[發(fā)明專利]一種棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的分離方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410371954.3
• 申請日: 2014-07-31
• 公開（公告）號: CN104152396B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張驍;趙翔;孔培濤;王雪嬌;高歌
• 申請（專利權(quán)）人: 河南大學(xué)
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 鄭州聯(lián)科專利事務(wù)所(普通合伙)41104
• 代理人: 時(shí)立新

1.一種棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的分離方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

（1）取棉花種子，誘導(dǎo)萌發(fā)；

（2）取步驟（1）中萌發(fā)3~4周后的棉花真葉，漂洗干凈，撕取表皮條，將收集的表皮條轉(zhuǎn)入酶解液中，于23~28℃水浴震蕩1.5~2h游離保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體；

（3）向步驟（2）中酶解結(jié)束后的混合液中加入混合液5~10倍體積的基本介質(zhì)，濾網(wǎng)雙層過濾，濾液低速離心，棄上清液，保留離心管管體下端1/3的溶液，所述低速離心為200~300轉(zhuǎn)/min，離心5~8分鐘；

（4）將步驟（3）中保留溶液加入基本介質(zhì)重新懸浮，高速離心，棄上清，所述高速離心為700~800轉(zhuǎn)/min，離心8~10min；重復(fù)此步驟2~3次，可獲得純凈的原生質(zhì)體；

步驟（3）、步驟（4）中所述基本介質(zhì)為液體，其組成為：谷氨酸鉀10?mmol/?L、MgCl_2?2?mmol/?L、?Mes?10?mmol/?L，山梨醇調(diào)滲透壓至550~600?mOsmol?/Kg，1?mmol/?L?KOH調(diào)pH至5.0~6.0。

2.如權(quán)利要求1所述棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的分離方法，其特征在于，步驟（2）中所述酶解液體系組成為：纖維素酶RS?1.3wt%、果膠酶Y-23?0.03wt%、牛血清蛋白BSA?0.25wt%、抗壞血酸?0.5?mmol/L，山梨醇調(diào)滲透壓至530~550?mOsmol?/Kg，1?mmol/?L?KOH調(diào)節(jié)pH至5.0~6.0。

3.如權(quán)利要求1所述棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的分離方法，其特征在于，步驟（1）中誘導(dǎo)棉花種子萌發(fā)的具體步驟為：取成熟飽滿的棉花種子，80℃水浴浸種2分鐘；浸種后，棉花種子在16?h光照/8?h黑暗、光強(qiáng)為22?KLux、溫度20~29℃、相對濕度60%至70%的條件下誘導(dǎo)萌發(fā)。

4.如權(quán)利要求1所述棉花保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的分離方法，其特征在于，步驟（3）中濾網(wǎng)為400目。