[發明專利]一種魚類組織中三種脫碘酶活性的測定方法

在審

• 申請號: 201410369496.X
• 申請日: 2014-07-31
• 公開（公告）號: CN104165988A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發明（設計）人: 李大鵬;劉子棟
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: G01N33/573
• 分類號: G01N33/573;G01N23/00
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 馬輝

技術領域

本發明動物生理學和生物化學技術領域，具體涉及一種魚類組織中三種脫碘酶活性的測定方法。

背景技術

目前關于脫碘酶活性測定的方法僅有一篇于1996年發表在Clinical?Biochemistry上的“一種用碘125標記的反三碘原腺甲氨酸為底物測定肝臟和腎臟中I型脫碘酶的方法”(Hotz,C.S.,Belonje,B.,Fitzpatrick,D.W.,L'abbe,M.R.,1996.A?Method?for?the?Determination?of?Type?I?Iodothyronine?Deiod?nase?Activity?in?Liver?and?Kidney?Using125I-Labelled?Reverse?Triiodothyronine?as?a?Substrate.Clinical?Biochemistry29,451-456.)。但該文獻沒有介紹Ⅱ型和Ⅲ型脫碘酶的測定方法。國內外文獻中有多篇涉及脫碘酶活性測定的內容，雖然都是利用放射性的碘標記物作為反應底物來測定脫碘酶的活性，但方法不盡相同，沒有統一的標準。

脫碘酶是一種硒蛋白，存在于細胞質膜中，它們對甲狀腺激素的代謝過程有著非常重要的調節作用，測定其活性對甲狀腺功能的研究以及發病機理有重要作用。脫碘酶活性表示為：每分鐘每毫克蛋白質釋放出的I的皮摩爾數或發摩爾數。(pmol/fmol?I?released·mg?protein^-1·minute^-1)。根據不同的物理化學特性、組織分布、底物特異性和對抑制劑的敏感性，脫碘酶可以分為三種類型：Ⅰ型脫碘酶(ID1)、Ⅱ型脫碘酶(ID2)、Ⅲ型脫碘酶(ID3)。這三種脫碘酶分別有著各自最適的反應底物。測定的方法是，用碘125標記相應的底物，經過一定時間的孵育之后，測定由脫碘酶脫下的碘離子的放射性強度，然后經過公式計算出脫碘酶的活性，脫碘酶的活性表示為每分鐘每毫克蛋白質釋放出的碘離子的發摩爾數。目前國內外還尚未見有測定魚類組織中三種脫碘酶活性的試劑盒，也沒有標準的測定方法。

發明內容

本發明的目的是根據現有技術的不足提供一種動物組織中三種脫碘酶活性的測定方法，本測定方法操作簡單方便，成本低，測定結果直接可靠。

本發明是通過如下技術方案實現的：一種魚類組織中三種脫碘酶活性的測定方法，其步驟包括：(1)稱取動物組織后用緩沖液將動物組織配制成質量濃度為1-2％的勻漿，并離心取上清夜；(2)測定所述上清液中蛋白質含量；(3)將所述上清液按照體積比1：1加入孵育液在37℃下孵育120min；將緩沖液按照同樣方法加入孵育液后在37℃下孵育120min作為對照組；測定Ⅰ型脫碘酶活性的孵育液為50000cpm¹²⁵I-rT₃，0.1μM?rT₃，15mM?DTT混合物；測定Ⅱ型脫碘酶的孵育液為50000cpm¹²⁵I-T₄，1nM?T₄，30mM?DTT混合物；測定Ⅲ型脫碘酶的孵育液為150000cpm¹²⁵I-T₃，1nM?T₃，30mM?DTT混合物；(4)加入BSA溶液終止反應后沉淀離心，取上清液用放射免疫計數儀分別測定總放射性及上清液的放射性cpm值，依據下述經驗公式分別計算動物組織中三種脫碘酶活性：

其中：其中SCc＝SC－BC；

BC：對照管的放射性計數；

SC：樣品管的放射性計數；

SA：孵育液中反應底物的含量/TC；

TC：總放射性計數。

優選的，所述緩沖液為0.1M的pH＝7.0的PBS緩沖液，其中含有2mM?EDTA，1Mm?DTT。

優選的，所述步驟(4)中BSA溶液4℃的質量體積濃度為5％的BSA溶液，BSA溶液的加入量與上清液的體積比為1：1。

優選的，所述步驟(4)中加入BSA溶液后沉淀是加入了質量體積濃度為10％的TCA溶液，并在3500r/min下離心30min，TCA溶液的加入量與上清液的體積比為2：1。