[發明專利]克倫巴胺適配體與檢測克倫巴胺的適配體電化學生物傳感器

有效

• 申請號: 201410369428.3
• 申請日: 2014-07-30
• 公開（公告）號: CN104152455A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 劉大嶺;陳丹;姚冬生;謝春芳
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N27/327;G01N27/26
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 劉宇峰

1.一種克倫巴胺適配體，其特征在于，所述適配體為含有GCGTAGCTACTCATAT序列、長度為20-25個堿基的單鏈DNA探針，即XnGCGTAGCTACTCATATYm，其中，X和Y表示任意核酸堿基，n和m表示整數。

2.根據權利要求1所述的克倫巴胺適配體，其特征在于：所述適配體的3’端進行氨基修飾。

3.根據權利要求1所述的克倫巴胺適配體，其特征在于：所述3’端氨基修飾基團為-NH₂-(CH₂)₇-。

4.一種檢測克倫巴胺的適配體電化學生物傳感器，其特征在于：所述的電化學生物傳感器中含有如權利要求1至3之一所述的適配體。

5.如權利要求4所述的適配體電化學生物傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)裸金電極表面的拋光及活化處理：將裸金電極用氧化鋁粉末打磨，用超純水超聲清洗去除氧化鋁粉末，將清洗好的裸金電極浸入新鮮配制的熱的Piranha溶液于20-25℃下活化10分鐘，得到活化的裸金電極；

(2)活化電極的適配體修飾：合成如權利要求1所述的適配體，配制100μmol/L的適配體溶液，加入到NaCl溶液中配制成2μmol/L適配體組裝液；將步驟(1)所得的活化的裸金電極浸入適配體組裝液中，4℃下組裝24小時，得到所述的適配體電化學生物傳感器。

6.根據權利要求4所述的適配體電化學生物傳感器可以用于克倫巴胺的檢測。

7.一種基于如權利要求4所述的適配體電化學生物傳感器的檢測克倫巴胺的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)對克倫巴胺標準溶液進行檢測，建立標準曲線：

將所述的適配體電化學生物傳感器作為工作電極，Ag/AgCl(飽和KCl)電極作為參比電極，鉑絲電極作為對電極；

將所述的適配體電化學生物傳感器用超純水沖洗，去除未結合的適配體，然后置于濃度為5mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]為1：1的含0.1mol/L?KCl的電解液中，進行交流阻抗分析，初始電位為0.22V，頻率為0.1-1.0×10⁵Hz，得到適配體電化學生物傳感器的交流阻抗圖譜及其阻抗值Ret0；

將交流阻抗分析后的適配體電化學生物傳感器用超純水沖洗后浸入濃度1.0pg/mL的克倫巴胺水溶液中，室溫孵育15分鐘，反應后用超純水沖洗去除非特異性吸附的克倫巴胺，然后置于濃度為5mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]為1：1的含0.1mol/L?KCl的電解液中，進行交流阻抗分析，初始電位為0.22V，頻率為0.1-1.0×10⁵Hz，得到濃度為1.0pg/mL的克倫巴胺標準液的交流阻抗圖譜及其阻抗值Ret1；

同理，將上述修飾電極依次放入濃度5.0pg/mL、10.0pg/mL、50.0pg/mL、5.0×10²pg/mL、1.0×10³pg/mL、5.0×10³pg/mL的克倫巴胺標準液中，分別于室溫下孵育反應15分鐘，分別進行交流阻抗分析，記錄其對應的交流阻抗圖譜及阻抗值Retn(n＝2,3…7)，并計算各標準液相對初始的適配體電化學生物傳感器的阻抗變化值△Ret，△Ret為各標準液對應的阻抗值Retn(n＝1,2,3…7)減去適配體電化學生物傳感器對應的阻抗值Ret0；

以濃度為1.0pg/mL、5.0pg/mL、10.0pg/mL、50.0pg/mL、5.0×10²pg/mL、1.0×10³pg/mL、5.0×10³pg/mL的克倫巴胺標準液濃度的對數為橫坐標，以這7種標準液對應的阻抗變化值△Ret為縱坐標作圖，建立標準曲線；

(2)對含克倫巴胺的樣品溶液進行定量檢測：

根據農業部1486號公告-1-2010所述方法對樣品中的克倫巴胺進行提取純化；將得到的克倫巴胺干粉用超純水溶解后過0.45μM濾膜，然后進行電化學檢測；

將交流阻抗分析后的適配體電化學生物傳感器用超純水沖洗后浸入從樣品溶液中提取純化得到的克倫巴胺水溶液中，室溫孵育15分鐘，反應后用超純水沖洗，然后置于濃度為5mmol/L的K₃[Fe(CN)₆]/K₄[Fe(CN)₆]為1：1的，含濃度0.1mol/L?KCl的電解液中，進行交流阻抗分析，初始電位為0.22V，頻率為0.1-1.0×10⁵Hz，得到樣品中克倫巴胺溶液檢測的交流阻抗圖譜及其阻抗值Rets；

通過步驟(1)建立的標準曲線，計算出Rets-Ret0對應的克倫巴胺濃度，即為樣品中克倫巴胺的濃度。