[發(fā)明專利]單唾液酸四已糖神經(jīng)節(jié)苷脂GM1原料的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410368540.5
• 申請日: 2014-07-30
• 公開（公告）號: CN104151372B
• 公開（公告）日: 2017-05-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 釧助勝;彭亞琦
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南利諾生物藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C07H15/10
• 分類號: C07H15/10;C07H1/00
• 代理公司: 郴州大天知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所(普通合伙)43212
• 代理人: 徐起堂

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種單唾液酸四已糖神經(jīng)節(jié)苷脂GM1原料的制備方法。

背景技術(shù)

單唾液酸四已糖神經(jīng)節(jié)苷脂GM1廣泛存在于哺乳類動物大腦細(xì)胞膜表面和中樞神經(jīng)組織中。單唾液酸四已糖神經(jīng)節(jié)苷脂GM1對神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)、促進神經(jīng)的生長和再生、促進神經(jīng)支配功能的恢復(fù)、保護神經(jīng)細(xì)胞膜等都有積極的作用。

目前獲取單唾液酸四已糖神經(jīng)節(jié)苷脂GM1的方法是從動物腦組織中提取分離。然而，神經(jīng)節(jié)苷脂種類多，在腦組織中含量少，特別是其分子組成、結(jié)構(gòu)物理化學(xué)性質(zhì)等因素十分相近，所以高純度GM1的提取分離難度大，特別是大規(guī)模工業(yè)化提取工藝還未見有報道和應(yīng)用。到目前為止，國內(nèi)GM1提取分離的工藝主要有Momoi.T方法和利用微生物轉(zhuǎn)化的方法或者用硅膠柱從混合神經(jīng)節(jié)苷脂中分離，成本太高，難以大規(guī)模應(yīng)用于臨床，操作步驟繁瑣、工藝復(fù)雜、并消耗大量有機溶劑，提取的GM1含量僅為腦組織含量的萬分之一，而且純度不高、僅為99%。

本領(lǐng)域技術(shù)人員渴望獲得一種成本低、純度更高、能大規(guī)模工業(yè)化提取的單唾液酸四已糖神經(jīng)節(jié)苷脂GM1原料，但一直沒有解決這個技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是提供一種成本低、純度更高、適于大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用的單唾液酸四已糖神經(jīng)節(jié)苷脂GM1原料的制備方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的單唾液酸四已糖神經(jīng)節(jié)苷脂GM1原料的制備方法，包括如下步驟：

a.取凍存新鮮豬腦，加水浸泡自然解凍，再用水清洗，然后加入豬腦重2-5倍重量的純化水用膠體磨勻漿10min，將勻漿所得漿液倒入提取罐中加熱至80-85℃后保溫10-20min，再按豬腦重每1kg加入2-5 ml的比例加入濃度為12mol/L的濃鹽酸攪勻、冷卻至20-50℃，再以3500-4000r/min的速度離心分離5min，然后去除上層乳濁液，收集沉淀物，即得純化腦蛋白；

b. 將經(jīng)上述步驟得到的純化腦蛋白加入甲醇進行勻漿，再用氫氧化鈉調(diào)pH值為7-9，然后攪拌，離心過濾，收集上清液，即得醇提液；

c. 將經(jīng)上述步驟得到的醇提液濃縮，得醇提濃縮液；

d. 將經(jīng)上述步驟得到的醇提濃縮液，調(diào)pH值為2-5，水解，然后離心分離，收集上清液，即得水解液；

e. 將經(jīng)上述步驟所得水解液連續(xù)多次循環(huán)超濾，截留分子量為1600道爾頓以上的物質(zhì)，得GM1的初純品，再將GM1的初純品超濾，去除分子量為1500道爾頓以下的物質(zhì)，既得GM1溶液純品；

f. 將經(jīng)上述步驟所得GM1溶液純品干燥，即得單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂GM1原料。

所述b步驟，將經(jīng)a步驟所得純化腦蛋白按豬腦重量3-6倍的比例加入濃度為75-95%的甲醇，膠體磨勻漿1次，倒入提取罐中，用6mol/L氫氧化鈉調(diào)pH值為7-9，加熱保溫至40-60℃攪拌3-8h，再以3500-4000r/min的速度離心分離5min，棄沉淀，收集上清液，即得醇提液。

所述c步驟，將經(jīng)b步驟所得醇提液，60-80℃條件下真空減壓濃縮至豬腦重量的1/3-1/5，即得醇提濃縮液。

所述d步驟，將經(jīng)c步驟所得醇提濃縮液，用6mol/L鹽酸溶液調(diào)pH值為2-5，60-80℃條件下水解3-5h，然后冷卻至20-50℃，以3500-4000r/min的速度離心分離5min，棄沉淀，收集上清液，再用6mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值為7-8，即得水解液。

所述e步驟，將d步驟所得水解液置于能截留分子量為1600道爾頓的中空纖維超濾膜內(nèi)進行連續(xù)多次循環(huán)超濾，截留分子量為1600道爾頓以上的物質(zhì)，得GM1的初純品，再將GM1的初純品置于能夠截留分子量為1500道爾頓的中空纖維超濾膜中超濾，去除分子量為1500道爾頓以下的物質(zhì)，得GM1溶液純品。

所述f步驟，將e步驟所得GM1溶液純品以﹣60℃冷凍干燥或噴霧干燥，即得單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂GM1原料。

本發(fā)明的方法利用ph梯度的極性有機溶劑少量的甲醇，經(jīng)調(diào)整ph值和溫度、能高效地將GM1從豬腦組織中經(jīng)過純化蛋白、醇提、濃縮、水解、提純、干燥步驟處理，所提取的GM1含量達到豬腦組織含量的千分之一，純度可達99.9%以上，詳見附圖，其各項質(zhì)量指標(biāo)都符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求；且有機溶劑用量少、工藝簡單、周期短，因而成本低。

本發(fā)明的方法簡單可控，能適用于大批量制備單唾液酸四已糖神經(jīng)節(jié)苷脂GM1原料，能夠一次性處理大量豬腦組織，純化量大，可以進行規(guī)模化生產(chǎn)，適于大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。