[發明專利]基因重組TNF-α衍生物RMP16及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201410367873.6
• 申請日: 2014-07-29
• 公開（公告）號: CN104177489A
• 公開（公告）日: 2014-12-03
• 發明（設計）人: 馬義;洪岸;姜石松
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C07K14/525
• 分類號: C07K14/525;C12N15/66;C12N15/70;C12N1/21;C07K1/16;A61K38/19;A61P35/00
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉;陳燕嫻

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，特別涉及一種基因重組TNF-α衍生物RMP16及其制備方法與應用。

背景技術

TNF-α是較早發現的、研究最為深入的腫瘤壞死因子家族成員之一，抗腫瘤作用強，參與多種生理病理過程的調節。人TNF-α為單拷貝基因，定位在第六號染色體上(6P^12-13)，與MHC基因群緊密連鎖；TNF-α的cDNA大小約2.76kb，由4個外顯子和3個內含子組成。人TNF-α前體由233個氨基酸殘基組成，包括由第1、2號外顯子編碼的76個氨基酸殘基的信號肽；切除信號肽后形成非糖基化的成熟的人TNF-α，為157個氨基酸殘基，相對分子量為17kDa.。其中第69位和101位為兩個半胱氨酸，可形成分子內二硫鍵，對維持其空間結構有重要意義。

TNF-α作為一種蛋白類因子，其生物學活性主要是通過和細胞膜上特異受體結合實現的。TNF-α有兩種受體，一種是存在于大部分細胞表面的分子量為55-60kDa.的腫瘤壞死因子受體Ⅰ(tumor?necrosis?factor?receptor?Ⅰ，TNFR?Ⅰ)，另一種是主要存在于造血細胞表面的分子量為75-80kDa.的腫瘤壞死因子受體Ⅱ(tumor?necrosis?factor?receptor?Ⅱ，TNFR?Ⅱ)。兩類TNFR均為跨膜糖蛋白，氨基酸序列分析顯示這兩種受體的胞外結構域的序列高度相似，都有保守的富含半胱氨酸的同源氨基酸序列；但是胞內結構域卻差異很大，TNFR?Ⅰ胞內段含有死亡結構域(death?domain，DD)，而TNFR?Ⅱ沒有DD。TNFR?Ⅰ在大多數種類細胞的表面都表達，且大部分生物學功能是由TNFR?Ⅰ介導，包括殺細胞、抗病毒、誘導ICAM-1及IL-6的表達、促進成纖維細胞增殖、激活NF-κB等。TNFRII主要傳遞胸腺細胞和NK細胞等淋巴細胞的增殖信號，通過促進TNF-α與TNFR?Ⅰ結合而增加TNFR?Ⅰ誘導的作用。根據細胞及其微環境的不同，激活TNFR?Ⅰ后可通過激活不同的信號途徑介導細胞增殖、凋亡、壞死性凋亡等程序。

TNF-α具有很好抗腫瘤作用，被認為是最具潛質的癌癥治療藥物。但TNF-α在體內易被腎快速排泄和被各種蛋白酶分解，很不穩定，半衰期較短(15-30min)。若希望達到療效，則必須頻繁注射大劑量TNF-α，進而導致嚴重的不良反應，甚至引起休克死亡。TNF-α的上述缺陷，嚴重限制了其實際臨床應用，

研究表明，小分子多肽具有分子量小、活性高、副作用小、無免疫原性、結構簡單、易于穿透腫瘤細胞等特點，已成為腫瘤藥物研發的新熱點。這些都預示著小分子TNF-α衍生物在臨床方面將有良好的應用前景。設計高穩定性、高生物活性的TNF-α衍生物，特別是能與血漿中的載體蛋白結合的小分子TNF-α衍生物，可提高其生物利用度，發揮天然TNF-α抗腫瘤的同時，也極大降低了天然TNF-α具有的副作用。具有重要的藥用價值和產業化前景。

發明內容

為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種基因重組TNF-α衍生物RMP16。該衍生物RMP16具有更高穩定性和更高生物活性。

本發明的另一目的在于提供所述基因重組TNF-α衍生物RMP16的制備方法。該制備方法根據TNF-α衍生物RMP16的氨基酸序列及大腸桿菌密碼子的偏好性，設計RMP16在原核表達系統的基因序列，采用基因工程技術，結合蛋白內含肽(intein)的可誘導剪切功能實現目的多肽RMP16的高效制備；該制備方法生產效率高，生產成本低。

本發明的再一目的在于提供所述基因重組TNF-α衍生物RMP16的應用。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種基因重組TNF-α衍生物RMP16，其氨基酸序列如下所示：MWQRPSSWIEGRLLTHTISRIAVSYQTKVNLL。

編碼所述的基因重組TNF-α衍生物RMP16的核苷酸序列為：

ATGTGGCAGCGCCCGAGCAGCTGGATTGAAGGTCGCCTGCTGACCCATACCATTAGCCGCATTGCGGTGAGCTATCAGACCAAAGTGAATCTGCTG；

所述的基因重組TNF-α衍生物RMP16的制備方法，包括以下步驟：

(1)設計并合成RMP16基因：

采用3條引物兩步法合成RMP16基因：

引物F1：