[發明專利]基因重組TNF-α衍生物RMP16及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201410367873.6
• 申請日: 2014-07-29
• 公開（公告）號: CN104177489A
• 公開（公告）日: 2014-12-03
• 發明（設計）人: 馬義;洪岸;姜石松
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C07K14/525
• 分類號: C07K14/525;C12N15/66;C12N15/70;C12N1/21;C07K1/16;A61K38/19;A61P35/00
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉;陳燕嫻

1.一種基因重組TNF-α衍生物RMP16，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

2.根據權利要求1所述的基因重組TNF-α衍生物RMP16，其特征在于：編碼所述的基因重組TNF-α衍生物RMP16的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

3.權利要求1或2所述的基因重組TNF-α衍生物RMP16的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)設計并合成RMP16基因：

采用3條引物兩步法合成RMP16基因：

引物F1：

5'-GGTGGTCATATGTGGCAGCGCCCGAGCAGCTGGATTGAAGGTCGCCTG-3'；

引物F2：

5'-GCTCACCGCAATGCGGCTAATGGTATGGGTCAGCAGGCGACCTTC-3'；

引物F3：

5'-CCACCATGCTCTTCCGCACAGCAGATTCACTTTGGTCTGATAGCTCACCGCAAT-3'；

其中，CATATG為Nde?Ⅰ酶切位點，GCTCTTCCGCA為Sap?Ⅰ酶切位點；GGTGGT和CCACCAT為保護堿基；

首先將引物F1和引物F2進行鏈延伸反應，然后以其產物為DNA模板，以F1和F3為引物，PCR反應制得RMP16基因；

(2)構建重組載體pTXB1-RMP16：

用Ndel酶和Sapl酶分別對質粒pTXB1和步驟(1)制得的RMP16基因進行雙酶切，再將雙酶切后的RMP16基因和雙酶切后的質粒pTXB1連接，得到重組載體pTXB1-RMP16；

(3)制備表達工程菌pTXB1-RMP16/ER2566：

用重組載體pTXB1-RMP16轉化表達宿主菌大腸桿菌E.coli?Strain?ER2566，得到表達工程菌pTXB1-RMP16/ER2566；

(4)表達和純化：

①誘導表達工程菌pTXB1-RMP16L/ER2566表達由目的多肽、蛋白內含肽和幾丁質結合域組成的“三元”融合蛋白；

②得到的“三元”融合蛋白用幾丁質柱進行純化，“三元”融合蛋白吸附于幾丁質柱中，然后含有β-巰基乙醇的溶液過柱并充滿幾丁質柱環境中，反應；β-巰基乙醇的作用是誘導蛋白內含肽的N端切割，釋放目的多肽；然后用洗脫幾丁質柱的溶液洗柱，收集洗脫液；

③利用高效液相色譜技術純化目的多肽，得到基因重組TNF-α衍生物RMP16。

4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟(1)中所述的鏈延伸反應的條件為：94℃，10min；60℃，5min；72℃，10min。

5.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟(1)中所述的PCR反應的條件為：94℃，5min；94℃、30s，60℃、30s，72℃、30s，31次循環；72℃延伸10min。

6.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟(4)②中所述的反應的條件為23℃反應24小時。

7.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟(4)②中所述的含有β-巰基乙醇的溶液的組成如下：20mM?Tris-HCI，0.5M?NaCl，1mM?EDTA，50mMβ-巰基乙醇，pH?8.0；

步驟(4)②中所述的洗脫幾丁質柱的溶液的組成如下：20mM?Tris-HCl，500mM?NaCI，1mM?EDTA，pH?8.0。

8.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于：步驟(4)③中所述的利用高效液相色譜技術純化目的多肽RMP16的步驟如下：

A、流動相A為在體積百分比5％乙腈中添加三氟乙酸得到，TFA的終濃度為體積百分比0.1％；流動相B為100％乙腈中添加三氟乙酸，TFA的終濃度為體積百分比0.1％；流速1mL/min，30min線性梯度洗脫；

B、線性梯度洗脫中流動相B由體積百分比0～58％，收集目的多肽洗脫峰，光吸收檢測波長為218nm；并進行質譜鑒定。