[發明專利]一種豆科植物根瘤固氮共生體固氮能力的快速評估方法

有效

• 申請號: 201410367320.0
• 申請日: 2014-07-29
• 公開（公告）號: CN105296605B
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發明（設計）人: 徐明愷;鄒謹;張惠文;李旭;張成剛
• 申請（專利權）人: 中國科學院沈陽應用生態研究所
• 主分類號: C12Q1/6841
• 分類號: C12Q1/6841
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;馬馳

本發明涉及了一種豆科植物根瘤固氮共生體系固氮效率的快速評估方法。主要步驟為：一)植物?根瘤菌轉錄本信息共提取；二)固氮酶表達原位檢測；三)以固氮酶基因nifH的相對轉錄豐度來評估大豆根瘤固氮共生體的固氮能力。本發明的優勢在于：(1)操作步驟簡單、方便；(2)可用于田間快速、實時檢測固氮水平。

技術領域

本發明涉及一種豆科植物根瘤固氮共生體固氮能力的快速評估方法。

背景技術

大氣中氮氣的比例占79％，但是所有的動植物以及大多數微生物都不能利用分子態氮作為氮源，而所有的生命都需要氮。生物固氮是指微生物將氮還原為氨的過程。據聯合國糧農組織(FAO)1995年的粗略估計，全球每年由生物固氮作用固定的氮量接近2×10⁶噸，占全球植物需氮量的約3/4。根據固氮微生物與高等植物以及其他生物的關系，可以分為三大類：自生固氮體系、共生固氮體系和聯合固氮體系。共生固氮是自然界最主要的固氮體系，包括根瘤菌與豆科植物、弗蘭克氏菌與非豆科植物、固氮藍細菌與植物以及藍細菌與真菌的共生體地衣等，其中根瘤菌與豆科植物的共生固氮最為突出。根瘤菌共生固氮是在豆科植物根瘤共生組織中進行的生理過程，根瘤的固氮活性和固氮效率將直接決定了豆科植物的生理特征。

豆科植物是我國重要的經濟作物。以大豆為例，大豆生長過程中，大豆植物與大豆根瘤菌形成的固氮共生體是大豆氮源的主要攝取途徑，大豆根瘤固氮共生體固氮能力的強弱直接影響著大豆的產量和品質，對大豆種植有著非常重要的指導意義。在此過程中，對大豆根瘤固氮共生體中根瘤菌編碼的固氮酶活性的檢測，是評估其固氮能力的基礎指標。但由于固氮酶本身不易提取且容易失活，另外受限于根瘤菌的生理特性，編碼固氮酶的相關基因僅在共生狀態下進行表達，因此目前對于固氮效率的檢測多采用間接方法。

目前，¹⁵N同位素稀釋法是確定豆科植物和根瘤菌固氮共生體固氮能力的常用方法，該方法檢測指標直接，但檢測周期長，并且需要提前施用同位素，所以不能用于田間檢測，也不能做到實時檢測。因此，實際農業產生需要一種能夠快速低成本評估大豆根瘤固氮共生體固氮能力的方法。

發明內容

本發明提供一種豆科植物根瘤固氮共生體固氮效率的快速、實時評估豆科植物根瘤固氮共生體系固氮能力的方法。

nifH基因是根瘤菌固氮酶的結構基因，存在于nif基因簇，其編碼產物是固氮酶的結構組分，nif基因是固氮的關鍵基因。

本發明通過提取根瘤總RNA，再將mRNA逆轉錄成cDNA，熒光定量PCR檢測利用nifH基因的表達豐度的檢測，可以分析不同環境中豆科植物根瘤固氮共生體中固氮酶基因的轉錄效率，進而間接評估不同實驗或田間條件下的豆科植物與根瘤菌的共生固氮效率的變化。

發明內容包括：

一種豆科植物根瘤固氮共生體系固氮能力的快速評估方法，包括：

一：植物-根瘤菌轉錄本信息共提取：(1)設定對照組和待測組，對照組和待測組分別由一個或兩個以上樣本組成，分別提取各樣本根瘤總RNA；(2)用分光光度計分別檢測各樣本中提取的總RNA，得到總RNA的濃度和質量；

二：固氮酶基因轉錄水平原位檢測：(1)分別將對各樣本的mRNA反轉錄成cDNA；(2)分別用熒光定量PCR方法轉錄各樣本的固氮酶nifH基因和參比基因16s，并用2^-ΔΔCt方法計算待測組相對于對照組，固氮酶nifH基因的相對轉錄豐度；

三：以固氮酶基因nifH的相對轉錄豐度來評估大豆根瘤固氮共生體的固氮能力。

所述樣本取自一株或兩株以上相同品種豆科植物。同組樣本中，豆科植物處于相同生長環境下；組間樣本中，豆科植物生長環境不同

具體而言包括如下步驟：