[發明專利]一種豆科植物根瘤固氮共生體固氮能力的快速評估方法

有效

• 申請號: 201410367320.0
• 申請日: 2014-07-29
• 公開（公告）號: CN105296605B
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發明（設計）人: 徐明愷;鄒謹;張惠文;李旭;張成剛
• 申請（專利權）人: 中國科學院沈陽應用生態研究所
• 主分類號: C12Q1/6841
• 分類號: C12Q1/6841
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;馬馳

1.一種豆科植物根瘤固氮共生體系固氮能力的快速評估方法，其特征在于，包括：

一：植物-根瘤菌轉錄本信息共提?。海?）設定對照組和待測組，對照組和待測組分別由一個或兩個以上樣本組成，分別提取各樣本根瘤總RNA；（2）用分光光度計分別檢測各樣本中提取的總RNA，得到總RNA的濃度和質量；

二：固氮酶基因轉錄水平原位檢測：（1）分別將對各樣本的mRNA反轉錄成cDNA；（2）分別用實時熒光定量PCR方法擴增各樣本的固氮酶nifH基因和參比基因16s，并用2^-ΔΔCt方法計算待測組相對于對照組，固氮酶nifH基因的相對轉錄豐度；

三：以固氮酶基因nifH的相對轉錄豐度來評估大豆根瘤固氮共生體的固氮能力。

2.根據權利要求1所述的評估方法，其特征在于，所述樣本取自一株或兩株以上相同品種豆科植物。

3.根據權利要求1所述的評估方法，其特征在于，包括如下步驟：一：植物-根瘤菌轉錄本信息共提?。?/p>

(1)設定對照組及待測組，分別取對照組及待測組內各個樣本的新鮮根瘤50-200mg ,在液氮中研磨成細粉狀，立即加入RNA提取液1-2ml，繼續研磨成勻漿；

將勻漿1-2ml轉移到離心管中，加入200-400ul氯仿，混勻；

加入50-100ulRNase-free 雙蒸水及50-200ul氯仿,混勻，離心5-20分鐘，4℃，12,000×g-16,000×g；

將600ul-800μl上清液轉移到RNase-free離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻，離心5-20分鐘， 12,000×g-16,000×g，棄上清；

加入1-2ml 70-80 %乙醇，混勻， 6000×g-8000×g離心4-7分鐘，倒出液體，留沉淀；

加入30-100μl RNase-free雙蒸水，混勻；

(2)分光光度計分別測定各樣本的RNA濃度和質量，并用RNase-free 雙蒸水將各樣本稀釋成同樣濃度；

二：固氮酶基因轉錄水平原位檢測：

(1)獲得的RNA進行反轉錄，將mRNA逆轉錄成cDNA；

(2)采用實時熒光定量PCR，以cDNA為模板分別擴增個樣本的固氮酶基因nifH和參比基因16s；

根據實時熒光定量PCR得到的Ct值，用2^-ΔΔCt方法計算分析待測組相對于對照組，固氮酶基因nifH的相對轉錄豐度；

三：以固氮酶基因nifH的相對轉錄豐度來評估大豆根瘤固氮共生體的固氮能力:

以nifH基因的相對轉錄豐度來評價固氮能力，當相對轉錄豐度為1時，表明待測組相對于對照組，固氮能力相同；當相對轉錄豐度低于1時，表明待測組相對于對照組，固氮能力低；當相對豐度大于1時，表明待測組相對于對照組，固氮能力高。

4.根據權利要求3所述的評估方法，其特征在于，步驟（1）中，取新鮮根瘤100mg，RNA提取液為Trizol-A+,加入量為1ml；步驟（1）中，將勻漿1ml轉移到Phase Lock Gel^TM管，加入400μl氯仿，混勻。

5.根據權利要求3所述的評估方法，其特征在于，步驟（1）中，所述混勻后，將勻漿分別冰上放置5-20和3-7分鐘，氯仿加入量分別為400μl和200μl。

6.根據權利要求3所述的評估方法，其特征在于，步驟（1）中，所述離心為4℃，12,000×g，離心15分鐘。

7.根據權利要求3所述的評估方法，其特征在于，步驟（1）中75%乙醇加入量為1ml，所述離心為4℃，7500×g，離心5分鐘。

8.根據權利要求3所述的評估方法，其特征在于，步驟（1）中室溫放置2-3分鐘后，加入30ulRNase-free雙蒸水。