[發(fā)明專利]一種生產(chǎn)高光學純度D-苯丙氨酸的方法

有效

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• 申請日: 2014-07-28
• 公開（公告）號: CN104152523A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發(fā)明（設計）人: 房月芹;周哲敏;朱龍寶;肖克;周麗;崔文璟
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P41/00
• 分類號: C12P41/00;C12P13/22;C12N11/14
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)高光學純度D-苯丙氨酸的方法，尤其是一種利用重組苯丙氨酸脫氨酶不對稱拆分DL-苯丙氨酸生產(chǎn)高光學純度D-苯丙氨酸的方法，屬于酶學與酶工程技術領域。

背景技術

D-苯丙氨酸廣泛應用于制藥工業(yè)，如用于生產(chǎn)治療2型糖尿病“那格列奈的”。D-苯丙氨酸的生產(chǎn)主要是化學合成，由于化學合成路線復雜，反應步驟多，副產(chǎn)物多，導致生產(chǎn)成本高昂。酶學方法由于其專一性高，副產(chǎn)物少，反應條件溫和，產(chǎn)率高等優(yōu)點，是一種綠色生產(chǎn)工藝。工業(yè)上采用轉(zhuǎn)氨酶不對稱轉(zhuǎn)化對消旋的DL-苯丙氨酸中的L-苯丙氨酸，生成α-酮酸，提純獲得D-苯丙氨酸。由于轉(zhuǎn)氨酶催化需要輔因子NADH，在催化過程中，輔因子需要多批次添加以維持酶的活性，而且轉(zhuǎn)氨酶的穩(wěn)定性差，半衰期短，生產(chǎn)過程控制復雜，導致D-苯丙氨酸生產(chǎn)的成本高。為此，需要尋找新的不對稱轉(zhuǎn)化DL-苯丙氨酸的新方法。苯丙氨酸脫氨酶能立體選擇性催化L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化生成反式肉桂酸，肉桂酸的溶解度較低，容易通過調(diào)節(jié)pH沉淀除去肉桂酸，從而獲得高純度的D-苯丙氨酸。

本方法是通過構建重組大腸桿菌，異源高效表達粘紅酵母苯丙氨酸脫氨酶，獲得工業(yè)級應用的酶，然后將酶固定化，構建填充床酶反應器，用于D-苯丙氨酸的生產(chǎn)。目前固定化酶采用的載體有海藻酸鈉、殼聚糖、樹脂等材料，這些固定化材料由于機械強度低，高度擴散限制，固定化酶的重復利用次數(shù)低。

本發(fā)明采用酵母來源的苯丙氨酸脫氨酶具有高活性、高穩(wěn)定性等優(yōu)點，一步催化獲得D-苯丙氨酸，生產(chǎn)過程與轉(zhuǎn)氨酶相比更加簡單。以介孔二氧化硅材料MCM-41作為固定化材料，采用化學修飾，將氨基嫁接在MCM-41的表面上，提供酶固定化的錨定位點，與酶進行共價連接，提高酶的穩(wěn)定性、重復利用次數(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種應用固定化苯丙氨酸脫氨酶(PAL)生產(chǎn)D-苯丙氨酸的方法，主要是以DL-苯丙氨酸溶液為底物，將固定化苯丙氨酸脫氨酶填裝入固定床得到固定床酶反應器，催化L-苯丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸和氨，最終得到高光學純的D-苯丙氨酸。

所述固定床酶反應器優(yōu)選將固定化酶與硅藻土混勻后填充玻璃柱得到。

所述固定床酶反應器進一步優(yōu)選將100-200個酶活單位的固定化苯丙氨酸脫氨酶(MCM-41-NH-GA-RgPAL)與100-120g的硅藻土充分混合，裝進徑高比為5:1，體積為450mL的玻璃柱中。所述固定化苯丙氨酸脫氨酶與硅藻土的用量分別優(yōu)選100U和100g。

所述固定床酶反應器的溫度優(yōu)選以循環(huán)夾套控制。

所述固定化苯丙氨酸脫氨酶的獲得方法，主要包括以下步驟：(1)MCM-41載體的修飾：以介孔二氧化硅MCM-41為載體，將氨基嫁接在MCM-41材料孔道中硅羥基上得到MCM-41-NH₂，提供共價固定的錨定位點；(2)制備MCM-41-NH-GA：取適量的載體MCM-41-NH₂與0.5％戊二醛在室溫下反應1h，然后用雙蒸水洗滌，盡可能洗去多余的戊二醛，室溫下干燥，制備成MCM-41-NH-GA；(3)固定化酶：1g?MCM-41-NH-GA與含有50mg酶活為4.2U/mg的酶溶液進行混合，在室溫下反應2h，獲得共價固定化酶MCM-41-NH-GA-RgPAL。

所述MCM-41載體的修飾優(yōu)選以下步驟：將1g?MCM-41、50mL無水甲苯、2mL3-氨基丙基三甲氧基硅烷180℃回流12h后用無水甲醇洗滌三次，真空干燥后備用，獲得修飾的載體MCM-41-NH₂。

所述制備MCM-41-NH-GA優(yōu)選以下步驟：取1g?MCM-41-NH₂載體與0.5％戊二醛(GA)在室溫下反應1h，然后用雙蒸水洗滌三次，盡可能洗去多余的戊二醛，室溫下干燥，制備成MCM-41-NH-GA。

所述固定化酶優(yōu)選以下步驟：取1g?MCM-41-NH-GA與50mg的酶活性為3-5U/mg的酶溶液(Tis-HlC緩沖液溶液，50mM,pH8.5)進行混合，在室溫下反應2h，獲得共價固定化酶MCM-41-NH-GA-RgPAL。

所述催化生產(chǎn)高光學純度D-苯丙氨酸的方法優(yōu)選以下步驟：以12mL/min的流速往固定床酶反應器中泵入100mM的DL-苯丙氨酸，溫度控制在50℃，當L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化率達到80％時，調(diào)整反應液的pH至5，沉淀產(chǎn)物肉桂酸后再調(diào)整至初始pH8.5，反應液泵入反應器繼續(xù)反應，直至光學純度超過99％時，反應結束。