[發明專利]一種生產高光學純度D-苯丙氨酸的方法

有效

• 申請號: 201410364770.4
• 申請日: 2014-07-28
• 公開（公告）號: CN104152523A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 房月芹;周哲敏;朱龍寶;肖克;周麗;崔文璟
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P41/00
• 分類號: C12P41/00;C12P13/22;C12N11/14
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

1.一種應用固定化苯丙氨酸脫氨酶生產D-苯丙氨酸的方法，其特征在于，以DL-苯丙氨酸溶液為底物，將固定化苯丙氨酸脫氨酶填裝入固定床得到固定床酶反應器，催化L-苯丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸，得到高光學純的D-苯丙氨酸。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定床酶反應器是由固定化苯丙氨酸脫氨酶與硅藻土混勻后填充玻璃柱得到。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述固定床酶反應器是將100-200個酶活單位的固定化苯丙氨酸脫氨酶與100-120g的硅藻土充分混合，裝進徑高比為5:1，體積為450mL的玻璃柱中，固定床酶反應器的溫度以循環夾套控制。

4.根據權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述固定化苯丙氨酸脫氨酶主要通過以下步驟獲得：(1)MCM-41載體的修飾：以介孔二氧化硅MCM-41為載體，將氨基嫁接在MCM-41材料孔道中硅羥基上得到MCM-41-NH₂，提供共價固定的錨定位點；(2)制備MCM-41-NH-GA：取適量的載體MCM-41-NH₂與0.5％戊二醛在室溫下反應1h，然后用雙蒸水洗滌，洗去多余的戊二醛，室溫下干燥，制備成MCM-41-NH-GA；(3)固定化酶：取適量的MCM-41-NH-GA與酶溶液進行混合，在室溫下反應2h，獲得共價固定化酶。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)具體是將1g?MCM-41、50mL無水甲苯、2mL?3-氨基丙基三甲氧基硅烷180℃回流12h后用無水甲醇洗滌三次，真空干燥后獲得修飾的載體MCM-41-NH₂；所述步驟(2)取1g?MCM-41-NH₂載體與0.5％戊二醛在室溫下反應1h，然后用雙蒸水洗滌三次，洗去多余的戊二醛，室溫下干燥，制成MCM-41-NH-GA。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)取1g?MCM-41-NH-GA與50mg的酶活性為3-5U/mg的酶溶液進行混合，在室溫下反應2h，獲得共價固定化酶MCM-41-NH-GA-RgPAL。

7.根據權利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述催化L-苯丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸包括以下步驟：以12mL/min的流速往固定床酶反應器中泵入100mM的DL-苯丙氨酸，溫度控制在50℃，當流出的反應液中L-苯丙氨酸轉化率達到80％時，調整反應液的pH至5，沉淀產物肉桂酸后再調整至初始pH8.5，將反應液泵入反應器繼續反應，直至流出的反應液中D-苯丙氨酸的光學純度超過99％時，反應結束。

8.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述苯丙氨酸脫氨酶是將苯丙氨酸脫氨酶在大腸桿菌中進行表達后獲得的。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，將SEQ?ID?NO.1所示的基因以pET-28a(+)為表達載體，在E.coli?BL21中進行表達得到苯丙氨酸脫氨酶。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，還包括對酶進行純化：(1)收集重組菌，破碎菌體后，離心取上清，上清液中加入硫酸銨粉末，至飽和度為35％，緩慢攪拌使其完全溶解；(2)調節pH值使酶液的pH保持在8.7，靜置半小時后低溫離心收集上清液，繼續加入硫酸銨至飽和度為55％，4℃靜置數小時后，低溫離心收集蛋白沉淀；(3)將沉淀溶解在25mM?Tris-HCl?pH8.7的緩沖液中并且4℃透析數小時。