[發明專利]一種利用大白菜球葉獲得再生植株的培養方法

有效

• 申請號: 201410364506.0
• 申請日: 2014-07-29
• 公開（公告）號: CN104115751A
• 公開（公告）日: 2014-10-29
• 發明（設計）人: 劉倩倩;劉維信
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及大白菜組織培養技術領域，特別涉及一種取材便利、成本低、重復性好以及無畸形芽的利用大白菜球葉獲得再生植株的培養方法。

背景技術

大白菜(Brassica?campestris?L.ssp.pekinensis(Lour)Olsson)是我國栽培面積最大的十字花科蕓薹屬植物，在全國蔬菜生產和消費中一直處于重要地位。目前生物技術在提高大白菜育種效率中的作用日益凸顯。組織培養作為最重要的生物技術手段之一，對大白菜種質材料的保存和快繁，以及在基因工程育種中獲得大量穩定的轉基因植株具有重要意義。大白菜屬于蕓薹屬AA基因組，攜帶有抑制芽再生的基因，較屬內其他基因組型離體再生難度大。不同品種之間再生頻率也存在較大差異。

此外，大白菜的商品性狀往往在結球后期才能充分的表現，對田間材料的綜合性狀調查也主要集中于該時期。若能在此時對發現的優良材料進行及時保存與擴繁，則能提前對優良大白菜材料展開育種利用。而目前的再生方法往往無法及時保存珍貴優良的種質材料，并且對于轉基因獲得成功的材料不能及時擴繁，無法為后續的研究提供大量研究材料，制約了大白菜生物技術育種的發展。

前人采用子葉、子葉柄-子葉、下胚軸、花器官(Pernell等，2002；孫寶娟等，2005)等外植體通過誘導不定芽獲得大白菜再生植株；采用小孢子、花藥、原生質體培養通過誘導胚獲得再生植株。在目前建立的再生體系中最常用的外植體為子葉柄-子葉，在此基礎上，不同研究者以保留不同比例子葉的子葉柄-子葉外植體進行再生，研究結果差異較大。而子葉柄-子葉外植體只能一次性取材，每次獲得的外植體數量有限。

大白菜真葉再生國內外研究較少。成細華等(2001)首先利用苗齡為3周的無菌苗頂部第2-3片嫩葉為外植體，切割為2-4mm見方，通過誘導愈傷組織獲得不定芽。在劉學成等(2011)的研究中，當大白菜無菌苗長出第2片真葉時，以第1片真葉的葉柄插入培養基，從葉柄基部誘導獲得不定芽；而將真葉片切割為5mm見方，平鋪在誘導培養基上則無不定芽分化。目前尚未見利用成株大白菜結球葉片進行植株再生的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種取材便利、成本低、重復性好以及無畸形芽的利用大白菜球葉葉片獲得再生植株的方法。省去以往大白菜組織培養過程中的無菌苗培養環節，使田間發現的優良植株及搜集的珍貴材料能夠得到及時保存和擴繁，并為大白菜基因工程研究提供新的受體。

本發明的技術方案是：一種利用大白菜球葉獲得再生植株的方法，其特征在于包括以下步驟：

1)選取結球期大白菜外部球葉，去掉葉柄。在無菌條件下，先用體積分數70％的酒精表面消毒30s，無菌水漂洗一遍。再倒入質量分數5％的NaClO溶液滅菌10min，無菌水輕輕漂洗15min，期間換水5-6次。消毒完畢，用滅菌吸水紙將葉片殘留水分吸干。

2)將滅菌后的葉片切分為邊長1.5-2.0cm的葉塊，避開較粗葉脈，葉正面向上平置于芽誘導培養基上。在光照強度1500-2000Lux，光周期16h/d，溫度24±1℃條件下進行培養。

3)外植體在芽誘導培養基中培養28d后，之后轉入MS基本培養基(表2)中繼續培養。將外植體上長度大于1.5cm的再生不定芽切下，轉入生根培養基誘導生根。以上培養條件均為：光照強度1500-2000Lux，光周期16h/d，溫度24±1℃。

4)再生芽基部形成大量毛根后，打開培養瓶蓋煉苗4-5d，將再生苗根部的生根培養基洗凈，栽入盛有固體基質的塑料花盆中?；|采用蛭石和草炭體積比1∶1混合而成。盆口用保鮮薄膜覆蓋保濕。3d后，在薄膜表面打少量小孔，后期打孔數逐漸增加，孔隙逐漸加大。覆膜培養10d后，揭去保鮮薄膜，將再生植株置于室溫下培養。基質栽培過程中，均給予自然光照。

步驟2)中所述的芽誘導培養基為MS+4mg/L6-BA+1mg/LNAA+4mg/LAgNO₃+30g/L蔗糖+0.7mg/L瓊脂，pH為5.8。

步驟3)中所述的生根培養基為MS+0.5mg/L?NAA+30g/L蔗糖+0.7mg/L瓊脂，pH為5.8。