[發(fā)明專利]從館藏干制麻蠅標(biāo)本中擴(kuò)增DNA條碼全長(zhǎng)方法及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410364117.8
• 申請(qǐng)日: 2014-07-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104651351B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-12-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡佳;岳巧云;邱德義;陳健;劉德星;魏曉雅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 岳巧云
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種從館藏干制麻蠅標(biāo)本中擴(kuò)增DNA條形碼全長(zhǎng)的方法及試劑盒。

背景技術(shù)

DNA條形碼技術(shù)是近幾年新興的利用生物本身普遍具有的一段保守性適中、容易獲得的基因片段作為標(biāo)準(zhǔn)，建立在現(xiàn)代先進(jìn)的DNA擴(kuò)增、測(cè)序和比對(duì)技術(shù)基礎(chǔ)之上的一種物種鑒定手段。與傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定相比，利用DNA條形碼進(jìn)行物種鑒定具有以下優(yōu)勢(shì)：對(duì)物種的鑒定將不再受物種發(fā)育狀態(tài)的限制，克服了卵、幼蟲(chóng)、蛹等無(wú)法直接鑒定的缺點(diǎn)；對(duì)鑒定者的經(jīng)驗(yàn)和專業(yè)背景知識(shí)大大降低，減少主觀判斷的干擾；物種的鑒定更加準(zhǔn)確快速，數(shù)據(jù)共享使構(gòu)建生物全球分子鑒定平臺(tái)成為可能。但由于國(guó)際上現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)有限，往往得到的種類的DNA條形碼數(shù)據(jù)在數(shù)據(jù)庫(kù)中不能找到相匹配的數(shù)據(jù)，達(dá)不到種類鑒定的目的。

新采集的標(biāo)本由于缺少相應(yīng)的分類專家得不到準(zhǔn)確的鑒定，環(huán)境的改變和人為的干擾，致使許多過(guò)去的常見(jiàn)種變成了瀕危種甚至滅絕。博物館中儲(chǔ)存著大量的昆蟲(chóng)標(biāo)本，多數(shù)是干制標(biāo)本，經(jīng)專家鑒定過(guò)的館藏干制昆蟲(chóng)標(biāo)本，尤其是物種定名用的模式標(biāo)本是獲取準(zhǔn)確種類DNA條形碼數(shù)據(jù)的重要來(lái)源，但由于館藏干制昆蟲(chóng)標(biāo)本儲(chǔ)存年代久，長(zhǎng)期處在高防蟲(chóng)和防霉化學(xué)試劑的環(huán)境中，DNA降解嚴(yán)重，用一般的擴(kuò)增方法，很難獲得長(zhǎng)片段。動(dòng)物中尤其是昆蟲(chóng)等節(jié)肢動(dòng)物作為DNA條形碼的COI片段長(zhǎng)度包括引物在內(nèi)為710bp左右，在保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，干制昆蟲(chóng)標(biāo)本中的DNA降解嚴(yán)重的情況下，一般不能或者很難擴(kuò)增出DNA條形碼全長(zhǎng)的序列。因此很有必要研制一種有效的可以擴(kuò)增DNA條形碼全長(zhǎng)的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的首要目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足之處，提供一種從館藏干制麻蠅標(biāo)本中擴(kuò)增DNA條形碼全長(zhǎng)的方法。該方法速度快且重復(fù)性好。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種從館藏干制麻蠅標(biāo)本中擴(kuò)增DNA條形碼全長(zhǎng)的試劑盒。

本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種從館藏干制麻蠅標(biāo)本中擴(kuò)增DNA條形碼全長(zhǎng)的方法，包含以下步驟：

(1)設(shè)計(jì)PCR所需要引物，如下：

LCO1728：5'-TCCTCGAATAAATAATATAAGTTTT-3'；

HCO1856：5'-GATAAACAGTTCATCCTGTTCCAGC-3'；

LCO1490：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'；

HCO2198：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'；

(2)提取館藏干制麻蠅標(biāo)本的基因組DNA；

(3)擴(kuò)增：

①以步驟(2)得到的基因組DNA為模板，以LCO1490為上游引物，HCO1856為下游引物，進(jìn)行PCR，得到片段A；

②以步驟(2)得到的基因組DNA為模板，以LCO1728為上游引物，HCO2198為下游引物，進(jìn)行PCR，得到片段B；

(4)測(cè)序：將步驟(3)得到的片段A和片段B分別克隆到克隆載體上，測(cè)序；拼接，得到從館藏干制麻蠅標(biāo)本的DNA條形碼全長(zhǎng)；

所述的麻蠅包括羚足鬃麻蠅(Sarcorohdendorfia antilope)、擬羚足鬃麻蠅(Sarcorohdendorfia inextricata)、白頭亞麻蠅(Parasarcophaga albiceps)、海南刺麻蠅(Sinonipponia hainanensis)、曲突鉤麻蠅(Harpagophalla kempi)、棕尾別麻蠅(Boettcherisca peregrina)、郭氏歐麻蠅(Heteronychia quoi)、擬東方辛麻蠅(Seniorwhitea reciproca)、黑尾黑麻蠅(Helicophagella melanura)和盤突緬麻蠅(Burmanomyia pattoni)等等；

步驟(2)中所述的基因組DNA優(yōu)選通過(guò)動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取得到；

為了提高PCR所得的產(chǎn)物的準(zhǔn)確性，在PCR過(guò)程中最好使用高保真酶；步驟(3)中所述的PCR的反應(yīng)體系優(yōu)選為：5倍Phusion HF緩沖液10μl，10mM dNTPs 1μl，正向引物和反向引物各1μl，Phusion超保真DNA聚合酶0.5μl，基因組DNA 2μl，用ddH₂O補(bǔ)足50μl；