[發(fā)明專(zhuān)利]從館藏干制麻蠅標(biāo)本中擴(kuò)增DNA條碼全長(zhǎng)方法及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410364117.8
• 申請(qǐng)日: 2014-07-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104651351B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-12-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡佳;岳巧云;邱德義;陳健;劉德星;魏曉雅
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 岳巧云
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.一種從館藏干制麻蠅標(biāo)本中擴(kuò)增DNA條形碼全長(zhǎng)的方法，其特征在于包含以下步驟：

(1)設(shè)計(jì)PCR所需要引物，如下：

LCO1728：5'-TCCTCGAATAAATAATATAAGTTTT-3'；

HCO1856：5'-GATAAACAGTTCATCCTGTTCCAGC-3'；

LCO1490：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'；

HCO2198：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'；

(2)提取館藏干制麻蠅標(biāo)本的基因組DNA；

(3)擴(kuò)增：

①以步驟(2)得到的基因組DNA為模板，以LCO1490為上游引物，HCO1856為下游引物，進(jìn)行PCR，得到片段A；

②以步驟(2)得到的基因組DNA為模板，以LCO1728為上游引物，HCO2198為下游引物，進(jìn)行PCR，得到片段B；

(4)測(cè)序：將步驟(3)得到的片段A和片段B分別克隆到克隆載體上，測(cè)序；拼接，得到從館藏干制麻蠅標(biāo)本的DNA條形碼全長(zhǎng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述從館藏干制麻蠅標(biāo)本中擴(kuò)增DNA條形碼全長(zhǎng)的方法，其特征在于：所述的麻蠅為羚足鬃麻蠅(Sarcorohdendorfia antilope)、擬羚足鬃麻蠅(Sarcorohdendorfia inextricata)、白頭亞麻蠅(Parasarcophaga albiceps)、海南刺麻蠅(Sinonipponia hainanensis)、曲突鉤麻蠅(Harpagophalla kempi)、棕尾別麻蠅(Boettcherisca peregrina)、郭氏歐麻蠅(Heteronychia quoi)、擬東方辛麻蠅(Seniorwhitea reciproca)、黑尾黑麻蠅(Helicophagella melanura)或盤(pán)突緬麻蠅(Burmanomyia pattoni)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述從館藏干制麻蠅標(biāo)本中擴(kuò)增DNA條形碼全長(zhǎng)的方法，其特征在于：步驟(2)中所述的基因組DNA是通過(guò)動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取得到。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述從館藏干制麻蠅標(biāo)本中擴(kuò)增DNA條形碼全長(zhǎng)的方法，其特征在于：步驟(3)中所述的PCR中所使用的酶為Phusion超保真酶。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述從館藏干制麻蠅標(biāo)本中擴(kuò)增DNA條形碼全長(zhǎng)的方法，其特征在于：步驟(3)中所述的PCR的反應(yīng)體系為：5倍Phusion HF緩沖液10μl，10mM dNTPs 1μl，正向引物和反向引物各1μl，Phusion超保真DNA聚合酶0.5μl，基因組DNA 2μl，用ddH₂O補(bǔ)足50μl。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述從館藏干制麻蠅標(biāo)本中擴(kuò)增DNA條形碼全長(zhǎng)的方法，其特征在于：步驟(3)中所述的PCR的條件為：94℃變性5min；94℃40S、54℃40S、72℃1min，29個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述從館藏干制麻蠅標(biāo)本中擴(kuò)增DNA條形碼全長(zhǎng)的方法，其特征在于：步驟(4)中所述的克隆載體為T(mén)載體。

8.一種能實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述的方法的試劑盒，其特征在于包含如下兩對(duì)引物：

第一對(duì)：

LCO1490：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'；

HCO1856：5'-GATAAACAGTTCATCCTGTTCCAGC-3'；

第二對(duì)：

HCO2198：5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'；

LCO1728：5'-TCCTCGAATAAATAATATAAGTTTT-3'。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于：還包含酶、dNTP和反應(yīng)緩沖液中的至少一種。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于：所述的酶為Phusion超保真DNA聚合酶。