[發明專利]條件型伊維菌素受體IVMR轉基因小鼠模型的構建方法及應用

有效

• 申請號: 201410363847.6
• 申請日: 2014-07-28
• 公開（公告）號: CN104131036B
• 公開（公告）日: 2017-02-22
• 發明（設計）人: 丁玉強;胡玲;張玲;黃纓;張磊;宋寧寧
• 申請（專利權）人: 同濟大學
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司31225
• 代理人: 葉敏華

技術領域

本發明涉及條件型轉基因動物模型的構建方法及應用，尤其是涉及一種條件型伊維菌素受體IVMR轉基因小鼠模型的構建方法及在神經元功能研究中的應用。?

背景技術

神經科學研究領域中的一個關鍵問題就是特定神經元的活性(興奮性)與行為的因果關系。對這個問題，目前國際上已經發展出了不少新的方法，比如，突觸傳遞的分子操作方法、光遺傳學方法和配體門控的離子通道方法。特別是已發展出用配體門控的離子通道用于可誘導和可逆轉的調控神經元活性的方法。比如，果蠅Allatostatin受體在被Allatostatin激活的情況下，可以抑制神經元的動作電位的產生，這種方法已經在哺乳動物腦中開始使用。然而，Allatostatin這個分子不能透過血腦屏障，必須通過侵入性的方法(比如腦部打孔埋管)將其注射到腦中，這在進行大規模動物行為實驗時就顯得很不方便。最近，一種工程化的GABA_A受體已經用來沉默特定的腦神經元，特點是對藥物唑吡坦(zolpidem)不敏感。但是這個系統也有明顯的缺陷，就是必須在已經表達GABA_Aγ2亞基的神經元中起作用。第三種能夠降低神經元發放動作電位的系統就是伊維菌素IVM門控的氯離子通道(該通道來源于線蟲谷氨酸氯離子通道GluClα和β亞基)，已有報道顯示這種通道在小鼠腦中可以很好的起作用(Lerchner，W.et?al.2007.Reversible?silencing?of?neuronal?excitability?in?behaving?mice?by?a?genetically?targeted，ivermectin-gated?Cl-channel.Neuron?54，35-49.)。但是，該系統的一個大的限制就是需要同時表達α和β兩個亞基。為了克服這個問題，Lynagh等人將人源的甘氨酸α1受體進行了F207A和A288G兩個點突變，使該受體不再對甘氨酸敏感，而對伊維菌素IVM敏感(這個突變后的人甘氨酸α1受體被命名為伊維菌素受體IVMR)，這就提供了一種很好的可誘導和可逆轉沉默神經元的工具(Lynagh，T.&Lynch，J.W.2010.An?Improved?Ivermectin-activated?Chloride?Channel?Receptor?for?Inhibiting?Electrical?Activity?in??Defined?Neuronal?Populations.J?Bio?Chem?285，14890-14897)。但截至目前，國際上只有構建表達伊維菌素受體IVMR受體的病毒進行研究的報道，而將其制備為轉基因小鼠模型還未見報道。?

發明內容

本發明的目的就是為了針對現有缺乏伊維菌素受體IVMR轉基因小鼠的不足，而提供一種能夠更好的用于神經元的活性對動物行為的影響的研究的條件型(或稱誘導型)伊維菌素受體IVMR轉基因小鼠模型及其構建方法和應用。?

將IVMR的序列整體插入到Rosa26基因位點的下游(該基因為一個表達廣泛并且水平很強的基因)，緊接在一個loxP位點包圍的STOP元件后面。接著將這樣的質粒電轉進小鼠胚胎干細胞中進行同源重組，正負篩選、多次PCR進行篩選完成同源重組的胚胎干細胞。再將陽性的胚胎干細胞移植進母鼠的囊胚中，選取出生后嵌合水平最高的嵌合小鼠與野生型小鼠進行交配，鑒定為陽性的子代小鼠即為IVMR轉基因小鼠。該小鼠可與Cre重組酶小鼠進行交配或者在腦立體定位注入Cre表達病毒，這樣在特定的Cre重組酶的作用下，IVMR前面的STOP序列被剪切掉，IVMR得以在特定神經元中表達出來。在Cre表達的IVMR轉基因小鼠腹腔給藥IVM即可激活IVMR，降低神經元的活性。?

因此，本發明的一個目的是提供一種條件型表達伊維菌素受體IVMR的轉基因小鼠的模型。?

本發明的另一個目的是提供一種構建條件型表達伊維菌素受體IVMR的轉基因小鼠模型的方法，該方法包括以下步驟：?

(1)將IVMR-2A-GFP的序列插入到Rosa26基因位點的下游，緊接在一個loxP位點包圍的STOP元件后面，構建Rosa26-IVMR打靶載體；?

(2)將Rosa26-IVMR打靶載體電轉進小鼠胚胎干細胞中進行同源重組，經過正負篩選和PCR篩選完成同源重組的胚胎干細胞；?

(3)將陽性的胚胎干細胞移植進母鼠的囊胚中，選取出生的嵌合小鼠與野生型小鼠進行交配，鑒定為陽性的子代小鼠即為IVMR轉基因小鼠；?