[發明專利]一種通用型檢測血小板細菌污染的熒光定量PCR方法

在審

• 申請號: 201410363658.9
• 申請日: 2014-07-29
• 公開（公告）號: CN104372072A
• 公開（公告）日: 2015-02-25
• 發明（設計）人: 蒙青林;李勇;田晶晶;魏雙施;王紅梅;段生寶;丁少華;陳曄洲;李冬
• 申請（專利權）人: 中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 蘇州廣正知識產權代理有限公司 32234
• 代理人: 劉述生

技術領域

本發明涉及分子診斷和檢測領域，特別是涉及一種通用型檢測血小板細菌污染的熒光定量PCR方法。

背景技術

通過輸血傳播的病原體主要是病毒、細菌和原蟲等，我國目前納入血源篩查的項目僅有乙肝、丙肝、艾滋病毒和梅毒螺旋體。在輸血的感染性風險中，細菌污染和敗血癥性輸血反應尚未得到足夠重視。血小板制品必須在(22±2)℃條件下振蕩保存，這種環境下細菌污染的概率要高于其他血液成分細菌污染或病毒感染的概率，因此血小板制品有效保存期很短，一般規定是24小時或5天。研究表明，大約每3000單位的血小板制品中就有1個單位發生細菌污染，主要污染來源是獻血者皮膚菌群，獻血者存在無癥狀的菌血癥以及在制備過程中發生的污染。發生細菌污染的血小板制品如果輸注到病人體內，幾乎無例外都要引起輕重程度不等的輸血反應，甚至是致命的菌血癥和敗血癥。美國血庫協會（AABB）2004年規定所有血小板制品在輸注前均應作細菌污染檢測。我國衛生部在2004年專門討論了血液制品的細菌安全問題，但至今還沒有關于血液及血液成分細菌污染檢測的相關法律法規出臺。開展血小板細菌污染檢測，既是為了保證臨床血小板輸注的安全，同時也是為了充分有效利用有限的血小板資源。

血小板細菌污染檢測技術主要有三類：細菌培養檢測、血清學免疫檢測、核酸分子檢測。目前以細菌培養檢測方法作為金標準，其中通過FDA認證的有Bact/ALERT?細菌培養監測系統和PalleBDS細菌檢測系統，均是基于細菌培養生長繁殖過程中的各種指標變化，如消耗的O₂、累積的CO₂、營養成分改變等，這種方法檢測耗時較長，需要1～2天，會有漏檢的情形發生。此外，通過FDA認證的PGD試紙條檢測系統是采用細菌表面特異性抗原的單克隆抗體床旁快速檢測血小板制品細菌污染，但該方法不能作為血小板質量控制檢測方法，敏感性較差，對一些革蘭氏陰性細菌不易檢出。Scansystem系統則是利用單抗富集血小板濾過樣本，對其中的細菌DNA用通透劑和熒光劑進行標記，并用激光掃描確定污染情況，該方法檢測時間雖短，但靈敏度不高，最終結果判讀標準復雜。目前，國內尚未開發血小板細菌制品污染相關的檢測試劑及儀器。

核酸檢測（Nucleic?Acid?Test，NAT）一般是對各種病原生物的特異性靶標核酸序列進行定性、定量分析。在血液及血液制品的篩查和檢測領域，核酸檢測已經廣泛用來檢測樣本是否存在病毒感染，以降低輸血傳播病毒性傳染病的風險。如艾滋、乙肝、丙肝和梅毒（HIV，HBV，HCV，Tp）是血液相關樣本法定檢測的四項，目前都采用核酸檢測或聯合酶聯免疫檢測的方法進行確認。核酸檢測技術平臺主要是從PCR（聚合酶鏈式反應）、TMA（轉錄介導擴增）技術發展而來，其中的PCR技術應用最為廣泛。

熒光定量PCR是從PCR技術發展而來，它是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，可實時監控反應過程，通過計算機對產物進行分析，省略普通PCR的后續鑒定步驟，極大地簡化了定量檢測的過程，而且真正實現了絕對定量。熒光定量PCR檢測已經在臨床疾病診斷，優生優育檢測，動植物檢驗檢疫，食品安全，科學研究等不同領域得到應用。

發明內容

本發明主要解決的技術問題是提供一種通用型檢測血小板細菌污染的熒光定量PCR方法，該方法檢測快速、準確、可靠。

為解決上述技術問題，本發明采用的一個技術方案是：提供一種通用型檢測血小板細菌污染的熒光定量PCR方法，所述熒光定量PCR方法采用一對檢測細菌的通用型引物、一條適用于通用型引物的人工內參、第一條熒光標記的熒光探針和第二條熒光標記的熒光探針，所述兩條熒光探針采用不同的熒光標記，所述第一條熒光探針是用于檢測細菌的通用型熒光探針，所述第二條熒光探針是用于檢測人工內參的內參探針，采用常規的PCR擴增技術進行檢測。

在本發明一個較佳實施例中，所述一對檢測細菌的通用型引物為CR5-F上游引物和CR7-R下游引物，所述CR5-F上游引物為GTGTAGCIGTGAAATGCGTAGA，所述CR7-R下游引物為TTGCGICCGTAITCCCCAGGCGG，所述第一條熒光探針為CR6-probe?探針，所述CR6-probe?探針為6FAM-CAGGATTAGATACCCTG-BHQ1，擴增產物大小為202?bp。