[發(fā)明專利]一種通用型檢測血小板細菌污染的熒光定量PCR方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410363658.9
• 申請日: 2014-07-29
• 公開（公告）號: CN104372072A
• 公開（公告）日: 2015-02-25
• 發(fā)明（設計）人: 蒙青林;李勇;田晶晶;魏雙施;王紅梅;段生寶;丁少華;陳曄洲;李冬
• 申請（專利權）人: 中國科學院蘇州生物醫(yī)學工程技術研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 蘇州廣正知識產權代理有限公司 32234
• 代理人: 劉述生

1.一種通用型檢測血小板細菌污染的熒光定量PCR方法，其特征在于，所述熒光定量PCR方法采用一對檢測細菌的通用型引物、一條適用于通用型引物的人工內參、第一條熒光標記的熒光探針和第二條熒光標記的熒光探針，所述兩條熒光探針采用不同的熒光標記，所述第一條熒光探針是用于檢測細菌的通用型熒光探針，所述第二條熒光探針是用于檢測人工內參的內參探針，采用常規(guī)的PCR擴增技術進行檢測。

2.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述一對檢測細菌的通用型引物為CR5-F上游引物和CR7-R下游引物，所述CR5-F上游引物為GTGTAGCIGTGAAATGCGTAGA，所述CR7-R下游引物為TTGCGICCGTAITCCCCAGGCGG，所述第一條熒光探針為CR6-probe?探針，所述CR6-probe?探針為6FAM-CAGGATTAGATACCCTG-BHQ1，擴增產物大小為202?bp。

3.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述一對檢測細菌的通用型引物為CR6-F?上游引物和CR8-R?下游引物，所述CR6-F?上游引物為TTAGATACCCTGGTAGTCCA，所述CR8-R?下游引物為GAGCTGACGACAICCITGC，所述第一條熒光探針為CR7-probe?探針，所述CR7-probe?探針為6FAM-ACTCAAAIGAATTGACGG-BHQ1，擴增產物大小為291?bp。

4.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述一對檢測細菌的通用型引物為CR7-F?上游引物和CR9-R?下游引物，所述CR7-F?上游引物為GCAACGCGAAIAACCTTACC，所述CR9-R?下游引物為TGACGTCITCCCCACCTTC，所述第一條熒光探針為CR8-probe?探針，所述CR8-probe?探針為6FAM-TGAIATGTTGGGTTAAGTCC-BHQ1，擴增產物大小為243?bp。

5.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述一對檢測細菌的通用型引物為23S3CD-F?上游引物和23S3CD-R?下游引物，所述23S3CD-F?上游引物為CTCAACGGATAAAAGITAC，所述23S3CD-R?下游引物為GACCIAACTGTCTCACGAC，所述第一條熒光探針為23S3CD?-probe?探針，所述23S3CD?-probe?探針為6FAM-TGTCGGCTCITCICATCCT?-BHQ1，擴增產物大小為189?bp。

6.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述人工內參采用基因合成方式制備，兩端序列和所述一對檢測細菌的通用型引物完全匹配，中間80bp的序列和內參探針是人工設計的，與任何細菌及人類基因組沒有任何相關性，所述人工內參的結構為5’上游引物序列-人工序列-下游引物互補序列?3’。

7.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述人工內參加入到檢測樣本中，可設為最低檢出限或任意閾值，也可作為標準品，具有對檢測結果提供質控、判讀、定量參照功能。

8.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述熒光定量PCR方法中通過反轉錄熒光定量PCR檢測樣本中的RNA，與人工內參和相應DNA的Ct值進行比較，判斷細菌是否為活性菌。