[發明專利]一種利用擴增DNA片段長度多態性測定短鏈RNA的方法

有效

• 申請號: 201410362696.2
• 申請日: 2014-07-28
• 公開（公告）號: CN104120184A
• 公開（公告）日: 2014-10-29
• 發明（設計）人: 徐凱;唐放;張耀藝;馮梓浩;楊宇;吳秀錦;張菲菲
• 申請（專利權）人: 成都諾恩生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 楊兵

技術領域

本發明涉及分子生物技術領域，特別涉及一種用擴增DNA片段長度多態性定量測定短鏈RNA的方法。?

背景技術

microRNA?(即miRNA)?是一類調控基因表達的短單鏈小分子核糖核酸，由22個左右核苷酸（nt）組成。miRNA參與細胞的各種活動，影響并參與維持細胞的生理和分化狀態，特定miRNA表達量的變化還能反映生物的生理、病理特征，預示其作為鑒定多種疾病的生物標記的可能性。例如肝細胞所特有的miR-122，在血液中的水平變化就可以揭示肝臟受損的情形。miR-122為肝臟細胞所獨有，并在每個人類肝細胞中有13萬個，具有目前用于肝損傷鑒定的生物標記物所欠缺的專一性及靈敏度。盡管miRNA在這些病變中所起的作用還有待明確，機制有待進一步的揭示，但這已成為目前miRNA研究的一個最重要的方向。其中miRNA定量檢測方法的客觀性、靈敏度及標準化是將miRNA研究成果推向臨床疾病診斷應用的瓶頸和關鍵。?

已知人類擁有大約1千種以上的miRNA，與各種特定生理病理現象相關的miRNA表達量的動態范圍很大，從個位數級別到上萬，加上miRNA擁有超短的長度、相似的序列、二級構象、末端修飾及長度差異性等特性，給miRNA的純化和準確定量帶來很大的挑戰。?

目前應用較多的對miRNA進行定量測定的主流技術包括定量反轉錄PCR（RT-qPCR）及同時測定多種miRNA的能力的miRNA深度測序法（miR-seq）和microArray雜交測定法等。其它也有很多基于RNA/DNA雜交技術的高通量技術平臺，如NanoString?nCounter、nanopore?技術，但受制于這些方法本身的不完善，缺乏應有的靈敏度和準確性，距離實際應用尚需時日。?

上述miRNA測定方法實際應用的主要問題是靈敏度，如其中最靈敏的NanoString?nCounter法的測定低限為1?amol即約6x10⁵個分子以上的水平，而miR-seq和microArray的測定低限為0.1?fmol即6x10⁷個分子以上的水平，顯然不滿足大多數分子診斷的需求。?

其中miR-seq法，對miRNA的鑒定不依賴于miRNA序列，可以對miRNA新種的發現有不可替代的作用。而且其能統計出miRNA的相對讀數，而有很多研究中利用它作了很多病理診斷應用方面的探索，發現了很多有益的苗頭。但是，miR-seq的樣品處理需要利用RNA?Ligase、DNA?Ligase制備適用的cDNA庫，并經PCR擴增后才能上機檢出，作到相對定量。冗長的樣本制備過程及多種修飾酶的利用，破壞了待測目標數量與檢測讀值的線性相關性，影響miRNA測定的客觀性。因此，如果沒有更好的制備方法，miR-seq還不能作為miRNA定量測定的方法。?

反轉錄實時熒光PCR定量技術（RT-qPCR）是現代分子生物診斷方法中對RNA檢出最靈敏、最客觀可靠的方法，而且方法快捷，不需要特殊的設備。傳統的RT-qPCR測定對象是長鏈的RNA，如mRNA，所用primers長度通常在20nt以上。但是，成熟miRNA的總長度才22nt左右,測定miRNA的RT-qPCR必須經過特殊的修飾，使之能適合qPCR。除莖環引物可作miRNA的RT以外，鎖核苷酸引物(LNA)及多聚A聚合酶加尾-寡聚dT引發的RT也被應用于miRNA的定量測定。以利用TaqMan探針、莖環引物的反轉錄-qPCR方法為代表的實時熒光PCR定量法具備有測定單拷貝miRNA分子的能力，已經廣泛的用于miRNA的機制研究、疾病診斷、治療預后等的研究中。因其是所有方法中最靈敏、客觀、容易應用，是驗證從microArray、miR-seq方法獲得的miRNA表達譜的優選方法。盡管不斷的技術改進和對工藝的強化不斷地催生新的miRNA?qPCR檢測方法，但是，至少有兩大障礙阻止了這些技術在臨床應用中的接受度：方法質量的評估及方法的標準化。這兩個障礙嚴重影響到方法結果在不同批次、操作人員及實驗室之間的重復性，即測定結果存在不一致不穩定的缺點。?