[發明專利]一種利用擴增DNA片段長度多態性測定短鏈RNA的方法

有效

• 申請號: 201410362696.2
• 申請日: 2014-07-28
• 公開（公告）號: CN104120184A
• 公開（公告）日: 2014-10-29
• 發明（設計）人: 徐凱;唐放;張耀藝;馮梓浩;楊宇;吳秀錦;張菲菲
• 申請（專利權）人: 成都諾恩生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 楊兵

1.一種利用擴增DNA片段長度多態性定量測定短鏈RNA的方法，其特征在于，包括以下步驟：

首先利用至少兩種與待測短鏈RNA相比無天然同源序列的合成小RNA作為測定的內標，將這些作為內標的所述合成小RNA以不同分子數混合，形成動態小RNA標準分子梯度；

再以等量的所述動態小RNA標準與所述待測短鏈RNA混合，經由RNA反轉錄、cDNA加尾、PCR同步擴增及PCR產物DNA長度多態性片段的熒光定量分析,測得所述待測短鏈RNA擴增產生的DNA片段熒光強度在所述動態小RNA標準熒光強度梯度上的相對比例，從而實現所述待測短鏈RNA的相對定量。

2.如權利要求1所述的一種利用擴增DNA片段長度多態性定量測定miRNA的方法，其特征在于，測得所述待測短鏈RNA在所述動態小RNA標準梯度上的相對強度比例后，以待測短鏈RNA序列為模板合成短鏈RNA參照物，測定不同分子數量的待測RNA參照物在上述動態小RNA標準梯度上的相對比例，由此獲得待測短鏈RNA參照物的分子數目-相對強度的校正曲線，再利用所述待測短鏈RNA相對強度比例通過所述校正曲線，計算出樣品中待測短鏈RNA的絕對分子數量。

3.如權利要求1或2所述的一種利用擴增DNA片段長度多態性定量測定短鏈RNA的方法，其特征在于，所述待測短鏈RNA為miRNA或siRNA。

4.如權利要求1或2所述的一種利用擴增DNA片段長度多態性定量測定短鏈RNA的方法，其特征在于，所述RNA反轉錄過程中，所采用的引物為歐米茄引物。

5.如權利要求1或2所述的一種利用擴增DNA片段長度多態性定量測定短鏈RNA的方法，其特征在于，所述RNA反轉錄過程中，所采用的引物為莖環引物。

6.如權利要求5所述的一種利用擴增DNA片段長度多態性定量測定短鏈RNA的方法，其特征在于，所述莖環引物為經過長度編碼的莖環引物。

7.如權利要求6所述的一種利用擴增DNA片段長度多態性定量測定短鏈RNA的方法，其特征在于，所述長度編碼的方法為：在所述莖環引物的PCR靶位點與探針序列之間加上不同堿基數目，并調整引物5’端的堿基序列使之維持莖環的二級結構不變。

8.如權利要求2所述的一種利用擴增DNA片段長度多態性定量測定短鏈RNA的方法，其特征在于，所述校正曲線符合對數回歸的方式，表述為：aX^b，其中a、b為常數項，經對不同分子數目的所述合成小RNA的實際測定值而確定。

9.如權利要求1所述的一種利用擴增DNA片段長度多態性定量測定短鏈RNA的方法，其特征在于，所述與待測短鏈RNA相比無天然同源序列的合成小RNA的種數為三種。