[發明專利]一株產幾丁質酶的菌株及其在酶解幾丁質中的應用

在審

• 申請號: 201410361719.8
• 申請日: 2014-07-25
• 公開（公告）號: CN104130961A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發明（設計）人: 陳可泉;高聰;何珣;張阿磊;歐陽平凱
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N9/42;C12P19/26;C12R1/01
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 徐蓓

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一株從自然界篩選獲得的高效幾丁質降解菌株及該菌株在酶解幾丁質中的應用。

背景技術

幾丁質，別名甲殼素，主要存在于甲殼綱動物外殼、昆蟲外殼、真菌細胞壁中，是自然界中含量僅次于纖維素的第二大天然高分子化合物，由單體N-乙酰-D-氨基葡萄糖通過β-1,4-糖苷鍵連接而成。幾丁質經降解后可以生成多種產物，主要包括幾丁寡糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、殼聚糖、氨基葡萄糖等。這些產物目前在化工、食品、醫藥、材料、農業等領域應用廣泛。截至2011年，作為營養補充劑的氨基葡萄糖及其衍生物產品的全球銷售額已逾20億美元，預計到2017年，全球氨基葡萄糖產量可達46,600噸。

目前85%的商用氨基葡萄糖產品是通過酸水解海洋甲殼動物的外殼而獲得的。酸法降解幾丁質會產生大量的酸堿廢液，不僅會對環境造成污染，而且降解過程難以控制，產物混雜，生物學活性難以保證。目前也有嘗試利用微波輻射法水解幾丁質，通過控制水解時間和微波強度可得到不同分子量的產物，但是該法不僅生產技術要求高，難以推廣，而且對操作者可能會造成身體傷害。目前研究的熱點是酶法降解幾丁質，它具有條件溫和，成本低，產物活性高，環境友好的優點，在幾丁質高值化利用方面具有巨大的潛力，是目前功能性食品、材料科學及醫藥等領域的研究熱點之一。例如，中國專利CN?03112043.1公開了一種利用豚鼠氣單胞菌酶解幾丁質獲得幾丁質寡聚糖的方法。目前生物酶法降解幾丁質的主要產品是生產甲殼寡糖，獲得純度較高的N-乙酰-D-氨基葡萄糖仍較困難。

發明內容

本發明的第一目的是提供一株高效降解幾丁質的菌株，利用該菌所分泌的幾丁質酶可降解幾丁質獲得N-乙酰-D-氨基葡萄糖。?

為實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一株產幾丁質酶的菌株，其特征在于，其分類命名為Chitinibactersp.?GC72，已于2014年4月1日保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號：CCTCC?NO：M?2014113。

本發明菌株的形態學及生理生化特征如下：?

菌落顏色：乳白色。

需氧方式：需氧生長。

菌落大小：1.9?×0.8?μm

適宜生長溫度：34-40℃。

適宜生長pH：?6-8

菌體形態：短桿狀、鐮刀彎曲狀。

革蘭氏染色：陰性。

耐鹽生長范圍：0%-1%?NaCl。

上述Chitinibactersp.?GC72篩選方法，具體包括如下步驟：

（一）?樣品采集

我們從安徽阜陽市、江蘇南京市兩地獲得土壤、腐爛蝦殼共27份樣品，及時存于4℃保藏備用。

（二）?富集培養?

取50?mL肉湯培養基裝于500?mL三角瓶中，滅菌后接入待篩樣品0.1?g，37℃、200?r/min條件下搖瓶培養24?h，得到富集的菌液。

（三）?平板透明圈篩選

用無菌單層濾紙將富集培養液過濾，梯度稀釋至適當濃度，吸取約0.2?mL稀釋液涂布于篩選培養基平板，37℃培養5?d，觀察、挑取產透明圈菌株（見附圖1）將篩選獲得的菌株點樣于篩選培養基平板上復篩，37℃培養5?d，以菌體生長速度和透明圈大小為標準，擇優菌株做斜面保藏。

（四）?搖瓶復篩

50?mL搖瓶篩選培養基裝于500?mL三角瓶中，每瓶接入1環復篩菌株斜面菌種，37℃、200?r/min振蕩培養3?d，發酵液離心得粗酶液，測定酶活力，最終保留產酶活力最高的菌株，其中一株細菌幾丁質酶活達0.57?U/mL，命名為Chitinibactersp.?GC72。

其中各培養基成分如下：

富集培養基：腦心浸液肉湯（BHI）；

篩選培養基：20%濃度為0.5%的膠體幾丁質、磷酸二氫鉀0.3?g/L、磷酸氫二鉀0.7?g/L、硫酸鎂0.5?g/L；

發酵培養基：葡萄糖1?g/L、粉粒幾丁質2?g/L、蛋白胨1?g/L、磷酸二氫鉀0.3?g/L、磷酸氫二鉀0.7?g/L、硫酸鎂0.5?g/L。

本發明的第二個目的是提供上述菌株在發酵產幾丁質酶中的應用。