[發明專利]甲基化DNA富集試劑及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201410361087.5
• 申請日: 2014-07-25
• 公開（公告）號: CN104131004A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發明（設計）人: 李偉東
• 申請（專利權）人: 沈陽百創特生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司 21207
• 代理人: 金春華

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地涉及一種利用甲基化結合蛋白直接富集，轉化并鑒定尿液中甲基化DNA的試劑及其制備方法和應用。

背景技術

DNA甲基化(DNA?methylation)是指在DNA甲基化轉移酶(DNMT)催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將活性甲基轉移至DNA鏈中特定堿基上的化學修飾過程。哺乳動物基因組中，DNA甲基化多發生在CpG二核苷酸中的胞嘧啶的5位碳原子。DNA甲基化是一種表觀(epigenetic)修飾，它在不改變DNA序列的情況下，對個體的生長、發育、基因表達模式以及基因組的穩定性起到重要的調控作用，并且這種修飾在發育和細胞增殖的過程中是可以穩定傳遞的。近年來的大量研究表明，DNA異常甲基化與腫瘤的發生、發展、細胞癌變有著密切的聯系。目前基礎研究表明DNA甲基化異常在腫瘤發生、發展中的作用主要包括：(1)DNA甲基化異常促使C～T突變發生，研究表明DNA甲基化使胞嘧啶轉變成5?mC，而5mC的突變率比其他堿基(包括沒有甲基化的胞嘧啶)突變率高。同時DNA甲基轉移酶(DNMT)在催化突變反應方面有重要作用，參與導致C-U-T的轉換，包括p53在內的許多腫瘤抑制基因的5?mC在惡性腫瘤中都是突變的熱點，DNA甲基化異常在這些突變中發揮一定的作用。(2)DNA甲基化異常影響基因的表達。腫瘤組織中基因組甲基化狀態不同于正常組織，表現為整個基因組的低甲基化與部分區域特別是基因啟動子區CpG島的高甲基化共存，這種甲基化狀態與許多腫瘤相關基因的異常表達有關。腫瘤中基因組甲基化程度普遍降低，其中許多特異癌基因也出現低甲基化，同時伴隨它們的表達有不同程度的增加。有報道認為在細胞群體中，DNA低甲基化可能是導致腫瘤形成的原始細胞克隆增殖的關鍵因素之一。但低甲基化與基因表達的關系還有待進一步研究闡明。腫瘤細胞中許多抑癌基因的啟動子區CpG島發生高甲基化目前被廣泛研究，這種甲基化異常與該基因的轉錄抑制相關，并能通過有絲分裂穩定的遺傳。所以認為，啟動子區CpG島的異常高甲基化是抑癌基因失活的一種機制。研究發現在結直腸癌細胞株中，一個p16等位基因發生突變而未甲基化，另一個未突變但高度甲基化，最終該基因發生轉錄抑制。此外越來越多的基因被報道在腫瘤中因高甲基化而導致轉錄抑制，這些基因涉及細胞周期調控、生長和分化(ER基因)、血管生成(THBS1基因)、粘連和轉移(TIMP3基因)、DNA修復(MGMT基因)等多方面，表明高甲基化在腫瘤形成中發揮著作用。

DNA甲基化在腫瘤中的作用主要表現在以下幾個方面：一，甲基化的CpG島二核苷酸中的胞嘧啶以較高的頻率脫氨基變成胸腺嘧啶，造成基因突變；二，抑癌基因和DNA修復基因由于超甲基化而沉默；三，癌基因甲基化水平降低而活化；四，基因組總體甲基化水平降低使轉座子、重復序列活化導致染色體穩定性下降。這些因素是腫瘤發生、發展、轉移、惡化最終導致患者死亡的重要原因。DNA總體甲基化水平(即甲基化譜)和特定基因甲基化程度改變可作為腫瘤診斷指標。

目前常用的甲基化DNA檢測方法是從組織樣本中提取DNA進行甲基化DNA檢測。此種方法的缺點是不適合腫瘤的早期診斷。而早期腫瘤的治愈率遠高于晚期腫瘤。相應的死亡率也大大降低。因此能夠提高腫瘤早期診斷率的方法和技術一直是醫學界探索的重要目標。

尿液做為常規檢驗樣本，收集簡單，易于處理，可以大量獲得。如果能從尿液中富集甲基化DNA，那么當腫瘤出現DNA甲基化時，在早期階段即有可能被發現。醫生可以迅速采取必要的醫療措施，及早消除病患。

發明內容

本發明的目的是提供一種方法簡單、高效，可將富集和轉化一步完成的甲基化DNA富集試劑。

本發明的另一目的是提供一種利用甲基化DNA富集試劑富集尿液中甲基化DNA的方法。

本發明采用的技術方案是：一種甲基化DNA富集試劑，是一種由甲基化結合蛋白和帶有鎳配基的凝膠或磁珠合成的甲基化結合蛋白凝膠或甲基化結合蛋白磁珠。

上述的甲基化DNA富集試劑，所述的鎳配基的凝膠是金屬鎳螯合瓊脂糖凝膠；所述的鎳配基的磁珠是瓊脂糖鎳磁珠。

上述的甲基化DNA富集試劑，甲基化DNA富集試劑中含有穩定劑，所述的穩定劑包含PPG或Tween20。

上述的甲基化DNA富集試劑，所述的甲基化結合蛋白的DNA序列如SEQ?ID?NO.1所示。

上述的甲基化DNA富集試劑的制備方法如下：