[發明專利]甲基化DNA富集試劑及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201410361087.5
• 申請日: 2014-07-25
• 公開（公告）號: CN104131004A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發明（設計）人: 李偉東
• 申請（專利權）人: 沈陽百創特生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 沈陽杰克知識產權代理有限公司 21207
• 代理人: 金春華

1.一種甲基化DNA富集試劑，其特征在于：甲基化DNA富集試劑是由甲基化結合蛋白和帶有鎳配基的凝膠或磁珠合成的甲基化結合蛋白凝膠或甲基化結合蛋白磁珠。

2.如權利要求1所述的甲基化DNA富集試劑，其特征在于：所述的帶有鎳配基的凝膠是金屬鎳螯合瓊脂糖凝膠；所述的鎳配基的磁珠是瓊脂糖鎳磁珠。

3.如權利要求1或2所述的甲基化DNA富集試劑，其特征在于：甲基化DNA富集試劑中含有穩定劑，所述的穩定劑包含PPG或Tween20。

4.如權利要求1或2所述的甲基化DNA富集試劑，其特征在于：所述的甲基化結合蛋白的DNA序列如SEQ?ID?NO.1所示。

5.權利要求4所述的甲基化DNA富集試劑的制備方法，其特征在于方法如下：

1)按SEQ?ID?NO.1所示的DNA序列，人工合成甲基化結合蛋白基因，將得到的基因插入到載體質粒中，構建甲基化結合蛋白表達質粒，將質粒轉入大腸桿菌感受態細胞中，得到重組大腸桿菌；

2)將菌體細胞經溶菌酶裂解30分鐘后，超聲波破碎，離心，得到含有甲基化結合蛋白的裂解液，加入金屬鎳螯合瓊脂糖凝膠或瓊脂糖鎳磁珠，混合并在4℃孵育2小時，1000轉/分鐘離心，除去上清液，并用10ml?50mM?Tris-HCl?pH7.5，150mM?NaCl緩沖液洗兩次，每次用1000轉/分鐘離心，最后以1ml的50mM?Tris-HCl?pH7.5，150mM?NaCl緩沖液懸浮帶有甲基化結合蛋白的凝膠，制得甲基化DNA富集試劑。

6.權利要求1或2所述的甲基化DNA富集試劑在富集尿液中甲基化DNA的應用。

7.如權利要求6所述的應用，其特征在于方法如下：

1)取尿樣，3000轉/分鐘，取上清液；

2)向50ml上清液中加入甲基化DNA富集試劑10微升，于4-25℃下振蕩保溫1h；

3)1000轉/分鐘離心，除去上清液，以1ml的50mM?Tris-HCl?pH7.5，150mM?NaCl緩沖液將甲基化結合蛋白凝膠轉移到離心管中，離心除去上清液，即得富集了尿樣中甲基化DNA的甲基化結合蛋白凝膠。

8.權利要求1或2所述的甲基化DNA富集試劑在甲基化DNA富集試劑盒中的應用。