[發(fā)明專利]萊克多巴胺半抗原和抗原的制備方法及其在量子點(diǎn)免疫熒光試劑盒中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410361049.X
• 申請(qǐng)日: 2014-07-28
• 公開（公告）號(hào): CN105315165B
• 公開（公告）日: 2018-03-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 溫凱;吳小平;王照鵬;王文珺;王世恩;李向梅;陳銀輝;蘇麗芳;姚琳;許舒婷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京維德維康生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C07C217/62
• 分類號(hào): C07C217/62;C07C213/06;C07K14/765;C07K14/77;C07K1/107;C07K16/44;G01N33/531;G01N33/543
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種半抗原、抗原及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及一種萊克多巴胺半抗原和抗原的制備方法及其在量子點(diǎn)免疫熒光試劑盒中的應(yīng)用，用于檢測(cè)動(dòng)物組織和尿液中的萊克多巴胺殘留量，屬于免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

萊克多巴胺是一種醫(yī)藥原料，具有廣泛的生理效應(yīng)，可用于治療充血性心力衰竭癥的強(qiáng)心藥，且常用于支氣管哮喘、支氣管痙攣和產(chǎn)科疾病的治療。當(dāng)其用量增加到臨床用量的5-10倍時(shí)，可增加肌肉生長(zhǎng)，減少脂肪蓄積，是良好的營(yíng)養(yǎng)分配劑和生長(zhǎng)促進(jìn)劑。美國(guó)FDA在2000年批準(zhǔn)，可以用于動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重新配劑，廣泛地用于畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)。可以同時(shí)提高動(dòng)物的日增重，提高飼料利用率，提高動(dòng)物的蛋白質(zhì)含量。但是其在動(dòng)物體內(nèi)的殘留一旦經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體，會(huì)對(duì)食用者產(chǎn)生巨大危害，特別對(duì)心臟病、糖尿病、高血壓、甲亢、青光眼、前列腺肥大等病人危害更大，甚至死亡，如瘦肉精（萊克多巴胺是“瘦肉精藥物”中的一種）在上海曾經(jīng)引發(fā)幾百人的中毒事件；在臺(tái)灣由于從美國(guó)進(jìn)口的豬肉里含有瘦肉精，幾乎挑起一場(chǎng)政治爭(zhēng)端。目前我國(guó)禁止將β-激動(dòng)劑等藥物作為動(dòng)物促生長(zhǎng)劑使用。但長(zhǎng)期以來(lái)，各種因非法使用β-激動(dòng)劑而造成的中毒事件時(shí)有發(fā)生。為打擊非法用藥，保護(hù)消費(fèi)者的健康與安全，迫切需要健全相關(guān)的檢測(cè)方法。

目前，獸藥殘留檢測(cè)常用的方法有氣相色譜、高效液相色譜以及氣質(zhì)聯(lián)用等理化分析方法。雖然這些方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，但是樣品前處理操作步驟繁瑣，成本較高，也不適用于大批量樣品的篩選檢測(cè)。免疫化學(xué)分析鑒于在抗原抗體的定性定量方面獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和操作簡(jiǎn)便快速、成本低、靈敏度較高、分析樣本量大的優(yōu)點(diǎn)彌補(bǔ)了理化分析的不足，在萊克多巴胺的殘留檢測(cè)中起著越來(lái)越重要的作用。

影響免疫化學(xué)分析質(zhì)量的根本因素是抗體的特異性與親和性，這些性質(zhì)又決定于免疫半抗原分子的結(jié)構(gòu)，因此免疫半抗原的分子設(shè)計(jì)與合成是產(chǎn)生特異性抗體和建立小分子獸藥殘留快速檢測(cè)技術(shù)的最基礎(chǔ)和最關(guān)鍵的步驟。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種萊克多巴胺半抗原和抗原的制備方法及其在量子點(diǎn)免疫熒光試劑盒中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的萊克多巴胺半抗原，為式（Ⅰ）所示的化合物；

式（Ⅰ）。

本發(fā)明還公開了式Ⅰ所示化合物的制備方法，包括如下步驟：

1、取500mg萊克多巴胺，溶于45ml甲醇中，加入348.8mg 6-溴己酸和233mg氫氧化鉀，加熱至80℃回流反應(yīng)40~72小時(shí)。點(diǎn)板確定原料大部分轉(zhuǎn)化。

2、減壓濃縮。使用15ml復(fù)溶，使用制備薄層色譜板分離純化，展開劑DCM:ME=4:1，以萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)定位，取比其極性大的點(diǎn)，使用甲醇提取，濃縮即得RAC-BBAR。

本發(fā)明提供的萊克多巴胺抗原，是將式Ⅰ所示化合物和載體蛋白偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物。

常用載體蛋白均可采用，如牛血清白蛋白（BSA），卵清蛋白（OVA），人血清白蛋白（HSA），鼠血清白蛋白（MSA），甲狀腺蛋白（TG）或血藍(lán)蛋白（KLH）等。

所述式Ⅰ所示化合物與BSA偶聯(lián)得到的萊克多巴胺抗原的結(jié)構(gòu)見式Ⅱ：

本發(fā)明還公開了所述萊克多巴胺抗原的制備方法，包括如下步驟：

1、取RAC-BHAR半抗原160mg溶于10.7mlDMF中，攪拌使之充分溶解。加入EDC 221.75mg和NHS 191.4mg，室溫反應(yīng)3h。

2、稱取144.1mg BSA溶于15ml 0.1M 碳酸緩沖溶液（pH=9.6）中，攪拌10min，充分溶解。

3、將步驟1的活化液3.6ml，在冰水浴環(huán)境下逐滴加入到蛋白溶液中，邊加邊攪拌，室溫磁力攪拌（400rpm）反應(yīng)24h。

4、將反應(yīng)產(chǎn)物裝入一個(gè)蒸餾水沖洗干凈的透析袋（15cm），1L PB（1×，pH7.2）室溫?cái)嚢瑁?00rpm）透析3d，每天換液3次（早中晚各一次），共計(jì)換液9次，將透析產(chǎn)物4500rpm離心6min，0.5ml/管分裝，將抗原編號(hào)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

OVA代替BSA，同法制備可得包被原。

所述萊克多巴胺抗原可以作為免疫原制備萊克多巴胺特異性抗體，也可以作為包被原制備微孔板。

應(yīng)用萊克多巴胺抗原制備得到的特異性抗體具體可為單克隆抗體或多克隆抗體。

所述萊克多巴胺抗原、所述特異性抗體均可應(yīng)用于檢測(cè)萊克多巴胺。

本發(fā)明還保護(hù)一種用于檢測(cè)萊克多巴胺的量子點(diǎn)免疫熒光試劑盒，包括量子點(diǎn)標(biāo)記的所述抗體。