[發明專利]萊克多巴胺半抗原和抗原的制備方法及其在量子點免疫熒光試劑盒中的應用

有效

• 申請號: 201410361049.X
• 申請日: 2014-07-28
• 公開（公告）號: CN105315165B
• 公開（公告）日: 2018-03-09
• 發明（設計）人: 溫凱;吳小平;王照鵬;王文珺;王世恩;李向梅;陳銀輝;蘇麗芳;姚琳;許舒婷
• 申請（專利權）人: 北京維德維康生物技術有限公司
• 主分類號: C07C217/62
• 分類號: C07C217/62;C07C213/06;C07K14/765;C07K14/77;C07K1/107;C07K16/44;G01N33/531;G01N33/543
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1.一種用于檢測萊克多巴胺的量子點免疫熒光試劑盒，包括量子點標記的特異性抗體；

所述抗體是通過以式Ⅰ所示的化合物與載體蛋白的偶聯物為免疫原得到的；

式Ⅰ；

所述式Ⅰ所示的化合物的制備方法是由如下步驟制得而成：

取500mg萊克多巴胺，溶于45ml甲醇中，加入348.8mg 6-溴己酸和233mg氫氧化鉀，加熱至80℃回流反應40~72小時，點板確定原料大部分轉化；減壓濃縮：使用15ml復溶，使用制備薄層色譜板分離純化，展開劑DCM:ME=4:1，以萊克多巴胺標準定位，取比其極性大的點，使用甲醇提取，濃縮即得RAC-BBAR，得到的干物質即為半抗原；

所述式Ⅰ所示化合物與載體蛋白結合的偶聯物的制備方法包括如下步驟：

取RAC-BHAR半抗原160mg溶于10.7mlDMF中，攪拌使之充分溶解，加入EDC 221.75mg和NHS 191.4mg，室溫反應3h；稱取144.1mg BSA溶于15ml 0.1M 碳酸緩沖溶液，pH=9.6，中，攪拌10min，充分溶解；將步驟1的活化液3.6ml，在冰水浴環境下逐滴加入到蛋白溶液中，邊加邊攪拌，室溫400rpm磁力攪拌反應24h；將反應產物裝入一個蒸餾水沖洗干凈的15cm透析袋，1L 1×，pH7.2 PB室溫100rpm攪拌透析3d，每天換液3次，共計換液9次，將透析產物4500rpm離心6min，0.5ml/管分裝，將抗原編號，-20℃保存備用；

所述量子點標記的特異性抗體是通過如下方法制備獲得的：

①取2.5mg量子點，用pH4.7、0.1M的MES緩沖液洗滌，然后用1ml pH4.7、0.1M的MES緩沖液重懸，加入0.96mg EDC和1.15mg NHS，37℃反應30分鐘，20000rpm離心5min，收集沉淀，即為活化后的量子點；

②取步驟①得到的活化后的量子點，用pH8.5、50mM的硼砂緩沖液洗滌，然后將2.5mg活化后量子點、所述蛋白質含量為0.15mg的抗體和pH8.5、50mM的硼砂緩沖液混勻，總體積為0.8ml，25℃反應3.5小時；

③取完成步驟②的液相，加入BSA并使其質量百分含量為5%，37℃反應30分鐘，20000rpm離心5min，收集沉淀，用pH7.4、0.02M的PBS緩沖液洗滌，用1ml pH7.4、0.02M的PBS緩沖液重懸；

④取步驟③得到的液相，用pH7.4、0.02M的PBS緩沖液稀釋至150000倍體積。

2.權利要求1所述一種用于檢測萊克多巴胺的量子點免疫熒光試劑盒，其特征在于，它包括：包被有萊克多巴胺抗原的微孔板、萊克多巴胺標準溶液、稀釋液、濃縮洗滌液、抗體工作液。