[發明專利]一種鑒定賴氨酸ε?氨基側鏈單甲基化修飾的方法

有效

• 申請號: 201410360062.3
• 申請日: 2014-07-25
• 公開（公告）號: CN105277712B
• 公開（公告）日: 2017-07-11
• 發明（設計）人: 程仲毅
• 申請（專利權）人: 杭州景杰生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司33100
• 代理人: 徐關壽,向慶寧

技術領域

本發明屬于檢測診斷領域，特別地，屬于一種鑒定及定量細胞或組織中賴氨酸單甲基化修飾底物的方法；更特別的，屬于利用特異性抗體的親和富集與質譜分析的蛋白組學方法鑒定及定量細胞或組織中賴氨酸單甲基化修飾底物。

背景技術

蛋白質賴氨酸殘基的ε-氨基側鏈可以發生單、雙或三甲基化修飾。在過去的幾十年里，對賴氨酸甲基化修飾(Kme)的生物學研究主要集中在核心組蛋白。前期的研究證明了這種修飾在染色體結構和功能行使中的關鍵作用。這種修飾狀態被2組具有相反催化功能的酶所調節，即賴氨酸甲基化轉移酶和賴氨酸去甲基化酶。目前有超過50個賴氨酸甲基化轉移酶和約25賴氨酸去甲基化酶被發現。組蛋白來氨酸甲基化修飾與各種疾病相關，例如癌癥。相應的，賴氨酸甲基化調節酶成為一系列潛在的藥物靶點。

當今在組蛋白中所發現的蛋白質翻譯后修飾類型(PTMs)在非組蛋白中都存在。在鑒定到的賴氨酸甲基化調節酶中，存在一些非細胞核定位的酶和新發現的不以組蛋白為底物的賴氨酸甲基化調節酶，說明賴氨酸甲基化應該在非組蛋白中廣泛分布。鑒定蛋白質底物是確定蛋白質翻譯后修飾功能的前提，賴氨酸甲基化生物學的研究歷史將該前提的重要性闡述的非常清楚。整合我們和他人的數據后發現，賴氨酸乙酰化底物出現在染色體結構、轉錄調節和如新陳代謝三個研究領域中，而且相互之間具有底物的重疊性。盡管賴氨酸乙酰化修飾的底物鑒定較遲，關于它的研究表明賴氨酸乙酰化在上述三個研究領域中是協同作用。類似地，賴氨酸甲基化修飾組的鑒定和定量比較發現了一些下游的與染色體無關的非組蛋白及信號通路，這為后續的功能研究打下堅實的基礎。

雖然如此，鑒定賴氨酸甲基化底物并不簡單。與鑒定磷酸化修飾用引入³²P標記不同，³H或¹⁴C的低放射性使放射性同位素檢測方法在賴氨酸甲基化底物鑒定上難以實施。甲基化，尤其是單甲基化(Kme1)，只在其底物中引入了一個很小的結構基團，因而被修飾的賴氨酸基團與未發生修飾的賴氨酸基團差別細微，只有一個極小的構象用來開發親和性抗體。若要同時兼顧親和性和特異性，開發與序列無關的甲基化抗體(泛抗體)是一個巨大挑戰。其結果是， 由于沒有合適的甲基化肽段富集方法為后續質譜分析提供肽段，賴氨酸甲基化底物的鑒定進程緩慢。正如磷酸化和賴氨酸乙酰化組學研究中描述，親和富集是研究蛋白質翻譯后修飾(PTM)整體分析的關鍵步驟(Kim,S.C.et al.Substrate and functional diversity of lysine acetylation revealed by a proteomics survey.Mol Cell23,607-618(2006))。由于單甲基化修飾的賴氨酸和未修飾的賴氨酸的物化性質差異很小，因此采用如分離磷酸化多肽的固定化金屬親和層析(IMAC)等化學方法來分離甲基化修飾的賴氨酸多肽很困難(Ficarro,S.B.et al.Phosphoproteome analysis by mass spectrometry and its application to Saccharomyces cerevisiae.Nature biotechnology20,301-305(2002))。另外，制備高特異性和高親和性的抗賴氨酸單甲基化的抗體也很困難。因此，需要對現有的基于蛋白質組學技術進行創新才能對賴氨酸甲基化修飾進行鑒定和分析。特別地，需要對賴氨酸單甲基化修飾的底物鑒定與定量分析方法進行全新的發明創造。

發明內容

為解決這個技術困難，本發明開發了一個新的化學蛋白質組學方法。利用該方法可以高效、準確的鑒定肽段中是否發生賴氨酸ε-胺基單甲基化修飾以及修飾的位點，定量分析修飾的變化水平。

一方面，本發明提供一種鑒定底物肽段或蛋白中是否在賴氨酸的ε-胺基上發生單甲基化修飾的方法，方法包括：采用體外氮酰化衍生化反應，讓所述的底物上的單甲基化ε-胺基的賴氨酸殘基衍生為酰甲基化ε-胺基；用抗酰甲基化的泛抗體親和富集發生酰甲基化修飾的肽段；用液質聯用質譜儀鑒定抗體親和富集的多肽是否發生了丙酰甲基化修飾。

優選的，根據液質聯用質譜儀檢測獲得的結果，并由此判斷或推定底物蛋白或肽段上是否實際存在的賴氨酸單甲化修飾。