[發(fā)明專利]一種鑒定賴氨酸ε?氨基側(cè)鏈單甲基化修飾的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410360062.3
• 申請(qǐng)日: 2014-07-25
• 公開（公告）號(hào): CN105277712B
• 公開（公告）日: 2017-07-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程仲毅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州景杰生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務(wù)所有限公司33100
• 代理人: 徐關(guān)壽,向慶寧

1.一種鑒定底物中賴氨酸殘基的ε-胺基上發(fā)生單甲基化修飾的方法，該方法包括：

1)采用體外氮酰化衍生化反應(yīng)，將底物上的賴氨酸殘基單甲基化ε-胺基衍生為酰甲基化ε-胺基；

2)利用特異性制備的酰甲基化賴氨酸泛抗體親和富集酰甲基化修飾的肽段；

3)利用質(zhì)譜和數(shù)據(jù)分析鑒定抗體親和富集的酰甲基化修飾的位點(diǎn)和多肽；

其中，所述的酰甲基化賴氨酸泛抗體為丙酰甲基化賴氨酸泛抗體，該方法還包括制備特異性的丙酰甲基化賴氨酸泛抗體，所述的制備特異性的丙酰甲基化賴氨酸泛抗體步驟包括如下步驟：

合成路線為：

其中，NHFMor為保護(hù)基團(tuán)；

合成的具體步驟如下：

(1)、2-1用二氯甲烷(DCM)溶解，常溫下持續(xù)通入新制HCl氣體1.5小時(shí)后，強(qiáng)酸下常溫繼續(xù)反應(yīng)5小時(shí)，TLC確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束；旋干后得粘稠固體，然后加硅膠拌樣進(jìn)行柱層析得到2-2；

(2)、2-2加入丙酮溶解，在加入NaHCO₃水溶液后室溫?cái)嚢?小時(shí)，讓其充分?jǐn)嚢瑁ピ现薪Y(jié)合的HCl；冰水浴下緩慢加入溶有丙酸酐的丙酮溶液，反應(yīng)1小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后2N鹽酸調(diào)pH 3.0左右，加入DCM進(jìn)行萃取，取有機(jī)相旋干得粘稠固體，加硅膠進(jìn)行柱層析得到2-3；

(3)、2-3加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和四氫呋喃(THF)溶解后加入哌啶，常溫?cái)嚢柽^(guò)夜，TLC確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束；油泵減蒸蒸干溶劑后得混合產(chǎn)物；加硅膠柱層析純化得酯化產(chǎn)物；加氫氧化鈉、等量水與甲醇體系進(jìn)行水解，冰水浴下反應(yīng)2小時(shí)，酯化產(chǎn)物完全水解后用2N HCl調(diào)至pH 3.0；旋干溶劑，再加入乙醇溶解產(chǎn)物，過(guò)濾后濾液旋干，得最終產(chǎn)物丙酰化單甲基賴氨酸小分子，對(duì)獲得丙酰化單甲基賴氨酸小分子再進(jìn)行小分子全抗原的制備，然后用制備好的抗原進(jìn)行免疫動(dòng)物，以及對(duì)免疫動(dòng)物獲得的血清進(jìn)行抗體的純化，最終獲得特異性的丙酰甲基化賴氨酸泛抗體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，底物賴氨酸殘基單甲基化ε-胺基衍生為丙酰甲基化ε-胺基。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，利用丙酰甲基化賴氨酸泛抗體對(duì)丙酰甲基化修飾的位點(diǎn)進(jìn)行富集。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，對(duì)底物賴氨酸殘基單甲基化ε-胺基進(jìn)行氮酰化修飾，修飾基團(tuán)的碳原子總數(shù)小于8個(gè)的烷基或者芳香基。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，所述的底物為多肽或者蛋白，酰化反應(yīng)可以在蛋白酶消化底物之前或者之后進(jìn)行。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，利用相應(yīng)的底物蛋白酰甲基化賴氨酸泛抗體對(duì)酰甲基化修飾的位點(diǎn)進(jìn)行富集。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,所要鑒定的賴氨酸殘基ε-胺基發(fā)生單甲基化修飾的底物為提取于任何細(xì)胞、組織或體液中獲得的蛋白或多肽。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，提取于任何細(xì)胞、組織或體液的底物蛋白質(zhì)可進(jìn)行體外的化學(xué)衍生化反應(yīng)；酰化試劑為具有穩(wěn)定同位素的酰化試劑。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，同位素酰化試劑為含碳，氫，氧，氮穩(wěn)定同位素的羧酸，酸酐，酰氯，羧酸酯，酰胺。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，對(duì)賴氨酸單甲基化修飾底物的定量分析，可以選擇穩(wěn)定同位素酰化試劑分析三組不同的賴氨酸單甲基化修飾底物；分析所述的三組不同的甲基化修飾底物，可以對(duì)其進(jìn)行¹²C₆H₁₀O₃，¹³C₆H₁₀O₃和¹²C₆D₁₀O₃分別標(biāo)記。

11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，細(xì)胞為可進(jìn)行基于細(xì)胞培養(yǎng)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記(SILAC)的永生傳代的細(xì)胞。