[發明專利]一種基于核酸適配體探針熒光傳感分析檢測待測樣本中的靶標物質的方法

有效

• 申請號: 201410360025.2
• 申請日: 2014-07-25
• 公開（公告）號: CN104178568A
• 公開（公告）日: 2014-12-03
• 發明（設計）人: 周小紅;向宇;王若瑜;施漢昌
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種基于核酸適配體探針熒光傳感分析檢測待測樣本中的靶標物質的方法。

背景技術

以核酸適配體為生物識別材料的傳感分析方法在最近二十多年得到了飛速發展。核酸適配體是一段能夠特異性識別目標污染物的RNA或單鏈DNA片段。早在上個世紀九十年代，Nature和Science期刊幾乎同時首次報道了核酸適配體材料及其篩選技術。經過二十幾年的發展，目前已經報道的核酸適配體材料已經可以檢測環境中的上百種物質。

以核酸適配體為生物識別元件的傳感分析方法包括可分為均相和非均相(或異相)適配體傳感分析兩種方法。目前，均相法的核酸適配體傳感技術仍然是主流。比如，University?of?Illinois?at?Urbana-Champaign大學Lu?Yi課題組利用在核酸適配體探針上固定熒光基團和猝滅基團，基于靶標物質識別后產生的DNA構象變化實現熒光信號的增強或減弱，從而建立起靶標物濃度與熒光信號的定量關系。均相反應速度快，檢測過程簡單，然而試劑消耗量大、檢測成本高。固相法通常以固定單鏈DNA探針為主，基于DNA探針對雜交鏈和靶標物親和能力的差異實現檢測。為實現多次使用，需要將雜交后的DNA鏈或靶標物洗脫。已經報道的洗脫方法包括：酸洗/堿洗、加熱、高鹽洗脫、EDTA螯合、表面活性劑洗脫等。缺點是穩定可重復使用的次數非常有限，通常在5-15次之間。究其原因是DNA的三級構象非常脆弱，在各種洗脫條件下，很難恢復到初始狀態。這樣低的穩定重復使用次數也極大限制了固相DNA技術的發展和適用范圍。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于核酸適配體探針熒光傳感分析檢測待測樣本中的靶標物質的方法。

本發明提供了一種檢測待測樣本中是否含有靶標物質的方法，包括如下步驟：

(1)將功能磁珠與所述待測樣本共孵育；所述功能磁珠是將(a)和(b)雜交得到的；所述(a)為表面修飾有特異識別靶標物質的核酸適配體的磁珠；所述(b)為連接有鏈霉親和素和標記物的探針；所述探針為與所述核酸適配體部分互補的單鏈核酸分子；

(2)完成步驟(1)后，進行磁分離，收集上清液；

(3)在與標記物相應的的激發波長激發下，采用表面修飾有脫硫生物素或生物素的固相芯片檢測步驟(2)得到的上清液，根據信號值判斷待測樣本中是否含有靶標物質。

所述表面修飾有脫硫生物素的固相芯片的制備方法包括如下步驟：

(Ⅰ)取固相芯片，使其表面羥基化；

(Ⅱ)完成步驟(Ⅰ)后，取固相芯片，使其表面修飾APTS；

(Ⅳ)完成步驟(Ⅱ)后，取固相芯片，使其表面修飾脫硫生物素。

“取固相芯片，使其表面羥基化”的方法具體如下：①將固相芯片浸入piraha溶液(98％濃H₂SO₄:H₂O₂＝3:1，體積比)并120℃反應1h；②完成步驟①后，取出固相芯片，用超純水清洗直到pH值為中性，在室溫下用氮氣吹干，然后置于70℃真空干燥箱中保存1h。

“取固相芯片，使其表面修飾APTS”的方法具體如下：①取固相芯片，置于APTS溶液中反應1h；②完成步驟①后，取出固相芯片，用無水甲苯沖洗，在室溫下用氮氣吹干，然后置于200℃烘烤1h。APTS溶液：溶質為APTS，溶劑為無水甲苯，溶質的濃度為2％(體積比)。

“取固相芯片，使其表面修飾脫硫生物素”的方法具體如下：①取固相芯片，置于戊二醛溶液中室溫反應1h，然后用乙醇沖洗，然后置于乙二胺溶液中室溫反應1.5h，然后置于NaBH₄溶液中室溫反應15min；②取25mg脫硫生物素、50mg?EDC和50mg?NHS，用1000μl?DMF溶解，室溫反應3h，然后加入200μl?pH8.7、1M的NaHCO₃-Na₂CO₃緩沖液并混勻，得到混合液；③完成步驟①后，取出固相芯片，加入步驟②得到的混合液中，室溫反應12小時；④完成步驟③后，取出固相芯片，用乙醇沖洗，然后置于含2mg/mL?BSA的PBS緩沖液中，室溫反應1h。戊二醛溶液：溶質為戊二醛，溶劑為乙醇，溶質的體積百分比濃度為2.5％。乙二胺溶液：溶質為乙二胺，溶劑為乙醇，溶質的體積百分比濃度為10％。NaBH₄溶液：溶質為NaBH₄，溶劑為乙醇，溶質的濃度為10mg/ml。