[發明專利]一種重組蛋白rPmt4p及其表達與在制備防治侵襲性白念珠菌感染疫苗中的應用

有效

• 申請號: 201410359895.8
• 申請日: 2014-07-25
• 公開（公告）號: CN104140460A
• 公開（公告）日: 2014-11-12
• 發明（設計）人: 閻瀾;王麗;王曉娟;姜遠英
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C07K14/40
• 分類號: C07K14/40;A61K39/00;A61P31/10;C12N15/81;C12R1/725;C12R1/865
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 趙青

技術領域

本發明屬于醫學和生物工程技術領域，具體涉及一種重組蛋白rPmt4p及其表達與在制備防治侵襲性白念珠菌感染疫苗中的應用。

背景技術

隨著抗腫瘤放化療、介入治療、器官移植術后免疫抑制劑的廣泛應用，尤其是艾滋病的流行，免疫功能低下或缺陷的病人數量不斷增加，侵襲性真菌感染已逐漸成為一種常見病、多發病，并已成為免疫功能低下人群死亡的主要原因。念珠菌是機會性致病真菌中的主要一屬，其中白念珠菌(Candida?albicans)的毒力最強，感染率最高，引起嚴重的侵襲性念珠菌病(invasive?candidiasis，IC)，死亡率高達40％。我國2013年最新統計數據表明，白念珠菌是侵襲性念珠菌血癥的主要病原菌，占57％左右。

Pmt4p是白念珠菌細胞壁上的甘露糖蛋白(Protein?mannosyltransferase)，Prill?SK等人研究發現，在小鼠尾靜脈注射5×10⁵PMT4基因缺失菌后與野生型對照組相比存活率是100％，證明了PMT4是與念珠菌菌絲生長及毒力有顯著性關系的基因(Prill?SK,et?al.(2005)PMT?family?of?Candida?albicans:five?protein?mannosyltransferase?isoforms?affect?growth,morphogenesis?and?antifungal?resistance.Mol?Microbiol?55(2):546-60)。

目前尚無文獻報道用生物工程方法制備重組Pmt4p蛋白，也尚無文獻報道Pmt4p蛋白用于預防或治療侵襲性念珠菌感染的研究。

發明內容

本發明的目的在于提供一種白念珠菌細胞壁上的甘露糖重組蛋白rPmt4p，本發明的另一目的在于提供該重組蛋白rPmt4p的表達，以及該重組蛋白rPmt4p在制備防治侵襲性白念珠菌感染疫苗中的應用。

本發明人研究發現，白念珠菌SC5314的細胞壁上的甘露糖蛋白Pmt4p(GENBANK?NO：3644096)的301至520氨基酸序列，可用于制備一種治療侵襲性念珠菌感染的蛋白疫苗。

本發明的第一方面，是提供一種重組蛋白rPmt4p，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

本發明的第二方面，是提供上述的重組蛋白rPmt4p在制備預防或治療侵襲性白念珠菌感染疫苗中的應用。

本發明的第三方面，是提供一種預防或治療侵襲性白念珠菌感染的蛋白疫苗，該蛋白疫苗的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

該蛋白疫苗是通過以下方法制備得到的：

A、克隆如SEQ?ID?NO:2所示的DNA序列；

B、構建含有如SEQ?ID?NO:2所示的DNA序列的重組質粒；

C、在真核表達系統釀酒酵母INVSc1中表達如SEQ?ID?NO:1所示的重組蛋白(rPmt4p)。

步驟A中，克隆DNA序列，以白念珠菌SC5314基因組DNA為模板，引物PMT4-Exp-F如SEQ?ID?NO:3所示，引物PMT4-Exp-R如SEQ?ID?NO:4所示。

步驟B中，構建重組質粒所用的質粒載體為PYES2/CT質粒。

本發明的具體技術方案如下：

1、Pmt4p蛋白表達基因的克隆

以白念珠菌SC5314基因組DNA為模板，引物PMT4-Exp-F：GCggatccATGTCTAGATCTGGCCCAGGTGATGC(SEQ?ID?NO:3)及PMT4-Exp-R：ATTTgcggccgcGAAATTCCAAATATTGTCC(SEQ?ID?NO:4)擴增，PCR擴增產物片段長度為660bp(SEQ?ID?NO:2)；

2、重組真核表達質粒的構建

將上述獲得的重組Pmt4p基因片段插入到PYES2/CT質粒中，構建PYES2/CT-PMT4重組質粒，將上述重組質粒轉化感受態細胞DH-5α，重組質粒酶切鑒定正確后送測序，序列如SEQ?ID?NO:2所示，重組片段序列與Pmt4p蛋白301至520氨基酸序列完全一致。

3、陽性重組質粒DNA的轉染

將酶切和測序結果都為陽性的重組質粒轉染到表達菌株釀酒酵母INVSc1中。

4、菌落PCR鑒定陽性轉染克隆