[發明專利]BCR?ABL融合蛋白突變體及其編碼基因、表達載體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201410359268.4
• 申請日: 2014-07-25
• 公開（公告）號: CN104212821B
• 公開（公告）日: 2017-04-05
• 發明（設計）人: 馮文莉;劉鑫;文良雪;黃崢蘭;李會
• 申請（專利權）人: 重慶醫科大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/63;C12N15/66;C12N9/12;A61K48/00;A61K38/45;A61P35/02
• 代理公司: 重慶市前沿專利事務所(普通合伙)50211
• 代理人: 郭云

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及BCR-ABL融合蛋白突變體及其編碼基因、表達載體及其構建方法，還涉及該BCR-ABL融合蛋白突變體及其編碼基因、表達載體在治療慢性粒細胞白血病中的應用。?

背景技術

BCR-ABL融合蛋白具有異常激活的酪氨酸激酶活性，是慢性粒細胞白血病(Chronic?myelogenous?leukemia，CML)的典型標志，大于90％的CML病人表達BCR-ABL融合基因，而正常細胞中不表達BCR-ABL融合蛋白，且ABL位于胞核，RIN1主要定位胞漿。位于ABL段的SH3結構與BCR-ABL蛋白激酶活性激活有著直接的關系，可負向調控BCR-ABL的活性，其關鍵位點的突變或結合配體的改變均可引起伊馬替尼(Imatinib，IM)耐藥。酪氨酸激酶抑制劑IM，在CML的治療中有可喜的成效，是治療CML的里程碑，但是由于BCR-ABL激酶區T315I突變等原因，造成臨床15％-20％病人對IM耐藥，給CML的治療帶來一定困難，因此，解決IM耐藥的問題已經成為CML研究的熱點之一。?

研究發現，RIN1蛋白——Ras抑制因子1，是ABL的一個直接的激活因子并且控制對IM敏感的調定點。該蛋白通過自身富含脯氨酸的序列(PPAVPPPPVP)與ABL的SH3(PxxP?motif)高特異性低親和力的結合，降低細胞對IM的敏感性，且RIN1與BCR-ABL的結合不受T315I突變的影響，亦不受除SH3、SH2和TKD以外的Abl結構域的影響。不同的慢性粒細胞白血病細胞株中RIN1蛋白的表達不同，這種表達的不同影響細胞株對IM的敏感性。例如，耐藥慢粒細胞株KCL22高表達RIN1蛋白，而對IM敏感的細胞株中RIN1表達較低，而K562細胞表達較低對IM敏感。?

目前，關于RIN1在CML方面的研究，主要包括：1.RNA干擾或者基因敲除后，和/或聯合IM，分析ABL激酶活性、ABL磷酸化底物水平的變化以及相關的信號通路的研究；2.利用RIN1ABD結構域靶向結合ABL的功能，在RIN1蛋白上連接有功能的酶、核定位信號?等功能片段，或者基因突變該結構，從而達到抑制ABL酪氨酸激酶活性的目的。以上方法，不能直接阻抑RIN1和BCR-ABL的結合，且RIN1在不同的細胞中表現不同的生理功能，如在乳腺細胞中RIN1是抑癌基因，因此敲掉后可能會誘發乳腺癌的發生。?

發明內容

本發明的目的是提供一種BCR-ABL融合蛋白突變體及其編碼基因、表達載體及其構建方法。?

本發明的另一目的是提供該BCR-ABL融合蛋白突變體及其編碼基因、表達載體在治療慢性粒細胞白血病中的應用。?

為了實現本發明目的，本發明提供的一種BCR-ABL融合蛋白突變體編碼基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示：?

AACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACTATCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCA?

本發明還提供了含有所述核苷酸序列SEQ?ID?NO:1的表達載體。?

所述表達載體為將所述的核苷酸序列SEQ?ID?NO:1插入穿梭質粒pAd-Track-CMV后與骨架質粒pAd-Easy-1重組得到。?

本發明還提供了構建所述含有核苷酸序列SEQ?ID?NO:1的表達載體的方法，包括如下步驟：?

(1)采用重疊延伸PCR方法進行擴增得到核苷酸序列SEQ?ID?NO:1的片段，包括三個反應體系：PCR1，PCR2和PCR3；PCR1以野生型ABL?SH3為模板，上下游引物為F/Rm3；PCR2以野生型ABL?SH3為模板，上下游引物為R/Fm3；PCR3以PCR1和PCR2的反應產物作為模板，上下游引物為F/R；所述引物序列為：?

F:5'-GCGTCGACAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATT-3',?

R:5'-CCGCTCGAGTCATGGCGTGATGTAGTTGCTTGG-3',?

Rm3:5'-ATTCCCCATTGTGAATATAGCCTAAGACCC-3,?

Fm3:5'-GTGGAGATAACtatCTAAGCATAACTAA-3'；?