[發明專利]阪崎腸桿菌單克隆抗體、雜交瘤細胞株及應用

無效

• 申請號: 201410359232.6
• 申請日: 2014-07-25
• 公開（公告）號: CN104130979A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發明（設計）人: 陸兆新;李遠宏;陳啟明;呂鳳霞;別小妹;趙海珍
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/12;G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌;唐循文

1.?一種雜交瘤細胞株，其特征在于，其保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏名稱為雜交瘤細胞株C232C，保藏號為CCTCC?NO：C2014102。

2.?一種阪崎腸桿菌單克隆抗體，其特征在于，由權利要求1所述的雜交瘤細胞株制備得到。

3.?一種權利要求1所述的雜交瘤細胞株的制備方法，其特征在于，按照以下步驟進行：

（1）阪崎腸桿菌OmpA蛋白的制備：采用PCR技術從阪崎腸桿菌基因組中擴增OmpA，克隆至表達載體中，IPTG誘導表達重組蛋白OmpA，經純化后作為免疫原；

（2）動物免疫、細胞融合和雜交瘤細胞的選擇：采用步驟（1）中的免疫原，對實驗動物進行注射免疫，免疫后取實驗動物的脾臟細胞與骨髓瘤細胞在融合劑存在的條件下進行細胞融合，測定效價，篩選細胞株，得到穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株；?

（3）分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株選擇：

1）通過將參考菌株接種培養于LB或NB液體培養基中，在30℃或37℃下培養12h后，分別將參考菌株培養液離心收集菌體，用PBS緩沖液沖洗后加入甲醛進行滅活菌體，調整各菌體濃度至10^8?CFU/mL，獲得阪崎腸桿菌及陰性參考菌株的細胞懸液；

2）分別將以上參考菌株的細胞懸液包被酶標板，包被濃度為10^6?CFU/mL，檢測方法為間接ELISA法，檢測和篩選得到雜交瘤細胞株C232C。

4.?一種權利要求2所述的阪崎腸桿菌單克隆抗體的制備方法，其特征在于，采用體內誘生腹水法將權利要求1所述的雜交瘤細胞株注射到預先注射石蠟的實驗動物腹腔內，回收腹水并從中獲得抗體，再用飽和硫酸銨或親和層析法純化腹水中的單克隆抗體。

5.?根據權利要求3所述的雜交瘤細胞株的制備方法，其特征在于，步驟（1）中表達載體為pET32a（+），純化為鎳離子親和層析技術純化。

6.?根據權利要求3所述的雜交瘤細胞株的制備方法，其特征在于，步驟（2）和步驟（4）中實驗動物為Balb/c小鼠。

7.?根據權利要求3所述的雜交瘤細胞株的制備方法，其特征在于，步驟（2）中骨髓瘤細胞為SP2/0骨髓瘤細胞；融合劑為聚乙二醇，測定效價的方法為間接ELISA法。

8.?根據權利要求3所述的雜交瘤細胞株的制備方法，其特征在于，步驟（3）中的參考菌株為粘質沙雷氏菌?（Serratia?marcescens?CICC?10187）、腸炎沙門氏菌（Salmonella?enteritidis?CICC?21482）、凝結芽孢桿菌（Bacillus?coagulans?CICC?20139）、金黃葡萄球菌（Staphyloccocus?aureus?AS?1.2465）、藤黃微球菌（Micrococcus?aureus?AS1.191）、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus?cereus?AS1.1846）、陰溝腸桿菌（Enterobacter?cloacae?ATCC?13047）、大腸桿菌(Escherichia?coli?BL₂₁)、阪崎腸桿菌(Cronobacter?sakazakii?ATCC?29544)或阪崎腸桿菌(Cronobacter?muytjensii?ATCC?51329)中的一種或幾種。

9.?一種免疫檢測試劑盒，其特征在于，含有權利要求2所述的阪崎腸桿菌單克隆抗體。

10.?權利要求9所述的免疫檢測試劑盒在檢測阪崎腸桿菌中的用途。