[發明專利]阪崎腸桿菌單克隆抗體、雜交瘤細胞株及應用

無效

• 申請號: 201410359232.6
• 申請日: 2014-07-25
• 公開（公告）號: CN104130979A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發明（設計）人: 陸兆新;李遠宏;陳啟明;呂鳳霞;別小妹;趙海珍
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/12;G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌;唐循文

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種阪崎腸桿菌單克隆抗體、雜交瘤細胞株及應用。

背景技術

阪崎腸桿菌(Enterobacter?sakazakii)，現克羅諾桿菌(Cronobacter?spp.)，是奶粉中新發現的一種食源性條件致病菌。該菌能引起新生兒及嬰幼兒腦膜炎、菌血癥和壞死性小腸結腸炎等疾病，死亡率高達40％～80％。阪崎腸桿菌能引起各年齡段人群感染，尤其是對早產兒、出生體重偏低、免疫力低下的嬰幼兒造成的危害是不可逆的。國際食品微生物標準委員會將其定為“嚴重危害特定人群，威脅生命或導致慢性實質性后遺癥”的細菌。

研究發現阪崎腸桿菌廣泛的存在于自然界中，目前已經從嬰幼兒配方奶粉、奶酪、UHT殺菌乳、谷類食物、香腸、香辛料、蔬菜等食品中發現了阪崎腸桿菌。此外，阪崎腸桿菌還廣泛存在于醫療環境中，食品加工廠各種儀器以及環境中。阪崎腸桿菌的廣泛存在嚴重的威脅了人類的生命健康，因此迫切需要建立一些簡單、高效、快速、準確的阪崎腸桿菌檢測方法。

目前，應用于阪崎腸桿菌檢測領域的方法主要有傳統的微生物培養法和PCR檢測方法。但是這些方法都存在檢測周期長、操作繁瑣等缺點，因而實現難以對污染源的快速診斷。近年來，微生物快速檢測技術取得了突飛猛進的發展，其中基于單克隆抗體的免疫學檢測方法呈現出了良好的應用前景。免疫學檢測方法依賴于抗原和抗體間的特異性反應，通過檢測標記在反應物上的示蹤物，對抗原或抗體進行定性或定量檢測。免疫學檢測技術具有高選擇性、靈敏、快速、一次可檢測多個樣品、操作簡單等特點，特別適合于大批量樣本的檢測，已廣泛應用于食源性致病微生物的快速檢測。

酶聯免疫吸附檢測方法(Enzyme-linked?immuosorbent?assay，ELISA)是目前免疫學檢測方法中應用最為廣泛，技術最為成熟的方法。ELISA以酶或者輔酶作為標記物，標記抗原或者抗體，用酶促反應的放大作用來顯示初級免疫學反應，并且利用聚苯乙烯微量反應板吸附抗原或者抗體，使其固相化，在其中進行免疫反應和酶促反應。ELISA具有選擇性好、結果判斷客觀準確、實用性強、樣品處理量大等優點，彌補了經典化學分析方法和其他儀器測試手段的不足。ELISA可以應用于致病菌快速檢測，關于沙門氏菌、單增生李斯特菌的ELISA檢測方法已經應用于食品的檢測中。

然而國內外針對阪崎腸桿菌單克隆抗體的研究較少，迫切需要一種能夠特異性識別阪崎腸桿菌的單克隆抗體制備技術，并將該單克隆抗體應用于ELISA檢測技術，以實現對食品、臨床及環境中阪崎腸桿菌的檢測和監測。阪崎腸桿菌的外膜蛋白A(Outer?membrane?protein?A，OmpA)在遺傳上具有較高的保守性，并且暴露于菌體表面，具有高的免疫原性，不僅可激發機體的體液免疫，而且還可誘導細胞介導的免疫應答，因而可作為一種良好的免疫原。

發明內容

技術問題

針對現有檢測技術存在的不足，本發明的目的是通過基因工程的方法以及雜交瘤技術得到雜交瘤細胞株，并獲得以阪崎腸桿菌OmpA為抗原的單克隆抗體，同時設計出了基于該單克隆抗體的酶聯免疫檢測試劑盒，為實現對阪崎腸桿菌的快速、靈敏、高通量的快速檢測提供了檢測手段與方法。

技術方案

本發明是通過以下技術手段實現的：

一種雜交瘤細胞株，于2014年5月28日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏名稱為雜交瘤細胞株C232C，保藏號為CCTCC?NO：C2014102，保藏地址為中國武漢武漢大學，郵編為430072。

一種阪崎腸桿菌單克隆抗體，由以上所述的雜交瘤細胞株制備得到。

一種以上所述的雜交瘤細胞株的制備方法，按照以下步驟進行：

(1)阪崎腸桿菌OmpA蛋白的制備：采用PCR技術從阪崎腸桿菌基因組中擴增OmpA，克隆至表達載體中，IPTG誘導表達重組蛋白OmpA，經純化后作為免疫原；

(2)動物免疫、細胞融合和雜交瘤細胞的選擇：采用步驟(1)中的免疫原，對實驗動物進行注射免疫，免疫后取實驗動物的脾臟細胞與骨髓瘤細胞在融合劑存在的條件下進行細胞融合，測定效價，篩選細胞株，得到穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株；

(3)分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株選擇：

1)通過將參考菌株接種培養于LB或NB液體培養基中，在30℃或37℃下培養12h后，分別將參考菌株培養液離心收集菌體，用PBS緩沖液沖洗后加入甲醛進行滅活菌體，調整各菌體濃度至10⁸CFU/mL，獲得阪崎腸桿菌及陰性參考菌株的細胞懸液；