[發(fā)明專利]一種食品蛋白來源ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)改良方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201410354871.3
• 申請日: 2014-07-24
• 公開（公告）號: CN104140456A
• 公開（公告）日: 2014-11-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹文紅;章超樺;郝記明;熊皓平;曹湛慧
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東海洋大學
• 主分類號: C07K5/083
• 分類號: C07K5/083;C07D207/16
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務(wù)所有限公司 44228
• 代理人: 李慧

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種食品蛋白來源ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)改良方法，具體涉及一種將肽中的酰胺鍵進行替換，使其成為含有非肽鍵結(jié)構(gòu)的擬肽物質(zhì)的改良方法，屬于生物技術(shù)研究領(lǐng)域。

背景技術(shù)

內(nèi)源肽以酶、激素、神經(jīng)肽、神經(jīng)遞質(zhì)和細胞活素的形式在機體的生理調(diào)節(jié)中起著重要的作用。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，食品蛋白質(zhì)氨基酸序列中的一些肽段具有廣泛的生理活性，如促進礦物質(zhì)吸收、降血壓、免疫促進等，在被吸收進入人體后亦能發(fā)揮某種生理調(diào)節(jié)活性。因此，食品蛋白質(zhì)來源的生物活性肽有著巨大的開發(fā)應(yīng)用前景，是近些年保健食品研究領(lǐng)域的熱點。由于人體內(nèi)消化系統(tǒng)對蛋白質(zhì)和肽的吸收有著層層阻礙，生物活性肽能否在人體內(nèi)完整地被吸收并傳送至目標位置，產(chǎn)生生理效應(yīng)，是廣大肽類藥物和保健品研究者關(guān)注的焦點問題。

肽和其他營養(yǎng)物質(zhì)的吸收主要在小腸絨毛上的吸收細胞上進行。當肽經(jīng)口腔進入胃腸道，在達到吸收細胞表面之前，消化道對肽的吸收有多重的阻礙作用。腸腔內(nèi)表面的黏液層以及消化道酶系的降解作用是肽吸收的最大阻礙。

除了分子的大小之外，肽吸收的一個重要的要求就是肽在接近腸腔內(nèi)吸收位點時在水相中的溶解性。為了進入腸上皮細胞膜，肽分子必須斷裂其與水相的氫鍵并與膜上的脂相反應(yīng)，要求至少有一定的親脂性。肽吸收的限速步驟是在腸腔內(nèi)壁的黏液層，以及腸上皮細胞表面不能攪動的水層。在到達細胞表面之前，肽必須穿過腸的黏液層。腸的黏液層覆蓋在小腸的內(nèi)壁，由高腳細胞分泌。黏液是細胞外的一種糖蛋白，包括不可移動的水相，更新周期為12~24h在體外試驗發(fā)現(xiàn)親脂性與藥物被吸收的量有著直接的關(guān)系。然而，肽的被動運輸并不嚴格隨親脂性的增加而增加，而是相反地與藥物和腸腔水相形成的氫鍵的數(shù)目有關(guān)。促甲狀腺素釋放激素，其肽鍵可逆或不可逆的N-乙酰化修飾能夠增加藥物的吸收。對弱酸或弱堿來說，親水性或極性受分子負電荷影響，分子顯著地受pK以及腸腔pH的影響。除了腸腔pH，吸收部位微環(huán)境的局部pH是影響滲透的決定因素。小的陽離子能夠透過腸上皮細胞之間的緊密接頭障礙。

肽除了在胃部黏液的穿透非常困難外，胃液中的胃蛋白酶和鹽酸將會在pH2~5之間引起蛋白質(zhì)的水解，特別是那些含天門冬氨酸的蛋白質(zhì)。大肽在胃部高度敏感，而小肽在這個環(huán)境中卻很穩(wěn)定。小腸上部的腸道酶如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、羧肽酶A和B等在pH8左右的活性最強，有各自的專一性，通過協(xié)作使得每一種蛋白質(zhì)都容易被酶解，能夠在10min內(nèi)將蛋白質(zhì)的30%~40%降解成2~6個氨基酸殘基的小肽。雖然大部分蛋白質(zhì)完全地被降解成小的片段，但還有相當一部分小肽在這些腸道酶中能夠保持穩(wěn)定。在腸道中限制吸收最主要的阻礙是刷狀緣膜上的肽酶和腸上皮細胞細胞質(zhì)中的酶。在腸道刷狀緣膜上的外肽酶與內(nèi)肽酶能夠?qū)⑽傅鞍酌负鸵让府a(chǎn)生的寡肽和蛋白質(zhì)片段酶解成氨基酸，二肽或三肽。對于四肽或以上的肽，在刷狀緣膜超過90%被水解，三肽10%~60%，而二肽是10%。選擇性降解三肽的肽酶位于刷狀緣膜，二肽較容易通過這個膜，卻容易被細胞質(zhì)中的酶降解。腸上皮細胞內(nèi)含有最豐富的水解小肽的肽酶，這些酶主要作用于二肽，對三肽也有一定作用。有證據(jù)顯示，含脯氨酸、羥脯氨酸的小肽或氨基酸容易被吸收進入門靜脈并在血液中以完整的形式出現(xiàn)，這些肽對細胞內(nèi)肽酶有一定的抵抗力。另外，某些氨基酸表現(xiàn)出具有調(diào)節(jié)刷狀緣膜肽酶活性的作用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種ACE抑制肽結(jié)構(gòu)的改良方法，解決食品蛋白來源活性肽在消化系統(tǒng)易被降解、吸收性能差及生物學效應(yīng)弱的問題。

為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種食品蛋白來源ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)改良方法，按如下步驟進行：

（1）利用蛋白酶解、微生物發(fā)酵法降解食品蛋白質(zhì)產(chǎn)生的ACE抑制肽，通過超濾、凝膠色譜、高效液相色譜、質(zhì)譜解析等技術(shù)手段進行分離鑒定，明確其氨基酸序列，一般含有2-5個氨基酸殘基。

（2）利用-CHOH-、-CO-CH₂-、-CH₂CO-等基團對ACE抑制肽氨基酸序列中的1-2個酰胺鍵進行替換，成為含有非肽鍵結(jié)構(gòu)的擬肽物質(zhì)，對使其不能被蛋白酶、肽酶識別，提高其穩(wěn)定性與吸收性能，提高生物利用度，增強生物活性。

（3）利用有機合成的方法對結(jié)構(gòu)改良后的擬肽進行合成，進一步進行毒理學性質(zhì)、藥效性質(zhì)、藥物代謝動力學等藥理學性質(zhì)檢測分析，明確活性及產(chǎn)品特征后即可進行大規(guī)模生產(chǎn)制備。