[發(fā)明專利]一種檢測水中大腸埃希氏菌的方法和檢測培養(yǎng)液

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410354559.4
• 申請日: 2014-07-24
• 公開（公告）號: CN104087652B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 單旭亮;毛芳芳;崔海松
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州綠潔水務(wù)科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/06
• 分類號: C12Q1/06
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11227
• 代理人: 趙青朵,馮瓊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測水中大腸埃希氏菌的方法和試劑盒。

背景技術(shù)

總大腸菌群(Total?Coliform)、耐熱大腸菌群(Thermotolerant?Coliform)和大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)是指示水體中糞便污染的最重要的3個細(xì)菌學(xué)指標(biāo)。這些菌屬可以在人、畜糞便中檢出，也可以在營養(yǎng)豐富的水體中檢出，即在非糞便污染的情況下，也有檢出這些細(xì)菌的可能性。耐熱大腸菌群組成與總大腸菌群組成相同，但主要組成是埃希氏菌屬，在此菌屬中與人類生活密切相關(guān)的僅有1個種，即大腸埃希氏菌，而其他如檸檬酸菌屬、克雷伯菌屬和腸桿菌屬所占數(shù)量較少。作為糞便污染的指示菌，大腸埃希氏菌檢出的意義最大，其次是耐熱大腸菌群，總大腸菌群的檢出意義略差一些。

目前，世界各國及國際組織都將大腸菌群數(shù)作為重要環(huán)境衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)，并對其提出了嚴(yán)格的限制。世界衛(wèi)生組織《飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(第二版)中規(guī)定，所有用于飲用的水中大腸埃希氏菌或耐熱大腸菌在任意100mL水樣中不得檢出；現(xiàn)行美國飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)國家一級飲用水標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定總大腸菌群為0CFU/ml；中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《生活飲用水水質(zhì)衛(wèi)生規(guī)范》規(guī)定，總大腸菌群、耐熱大腸菌群及大腸埃希氏菌每100mL水樣中不得檢出。

檢測大腸埃希氏菌等的傳統(tǒng)方法包括多管發(fā)酵法和濾膜法。多管發(fā)酵法適用于各種樣品，但操作復(fù)雜，檢測時間較長，濾膜法主要用于檢測雜質(zhì)較少的水樣，操作比多管發(fā)酵法更為簡單，但是不適合檢測高濁度和其他復(fù)雜水樣。這兩種方法都具有檢測周期長，程序繁瑣的缺點，難以適應(yīng)污染源快速診斷的需要。目前，國內(nèi)外研究人員已經(jīng)發(fā)展了一些新方法進(jìn)行大腸埃希氏菌等的快速檢測，主要包括酶底物法、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)、免疫分析法、生物傳感器法等。

其中酶底物法是已經(jīng)納入國標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)、免疫分析法、生物傳感器法等方法還不成熟。

與傳統(tǒng)方法相比，國標(biāo)酶底物法雖然將檢測時間縮短至24h，但是仍然不能滿足快速檢測的需要。以酶底物法為原理開發(fā)出來的在線實時監(jiān)測儀器價格昂貴，而且基本上都是以進(jìn)口產(chǎn)品為主。

中國專利200910148688.7公開了快速連續(xù)檢測糞大腸菌群及大腸菌群的方法，該方法以酶底物法為檢測原理，首先選擇培養(yǎng)液顯色底物，連續(xù)測定不同稀釋度糞大腸菌群或大腸菌群的生長曲線，通過生長曲線設(shè)定顯色底物特征值，然后測定不同稀釋度糞大腸菌群或大腸菌群顯色達(dá)到特征值所需時間，并建立初始濃度與達(dá)到特征值所需時間之間的線性關(guān)系，根據(jù)此曲線確定未知樣品的菌濃度。但是，該方法檢測對象是大腸菌群，其檢測方法并不適合用來檢測大腸埃希氏菌，同時最為關(guān)鍵的顯色培養(yǎng)基并未公開，而這些都是影響檢測準(zhǔn)確度和檢測時間的重要因素。此外，現(xiàn)有以酶底物法為原理的檢測方法都存在取樣量過少的問題，一般只能取到55.5-100mL，而取樣量多少可以影響檢測結(jié)果的不確定性。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測水中大腸埃希氏菌的方法，使得該方法能夠快速檢測出水中大腸埃希氏菌；

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種檢測水中大腸埃希氏菌的方法，使得該方法能夠增加待檢測樣本取樣量；

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種檢測水中大腸埃希氏菌的檢測培養(yǎng)液，使其能夠促使大腸埃希氏菌快速繁殖，縮短檢測時間。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種檢測水中大腸埃希氏菌的方法，包括如下步驟：

步驟1、提供一系列不同濃度的大腸埃希氏菌菌懸液，濃縮，分別加入到檢測培養(yǎng)液中培養(yǎng)，然后記錄各濃度下的大腸埃希氏菌菌懸液的特征時間，所述特征時間為各濃度下的大腸埃希氏菌菌懸液在365nm激發(fā)光下產(chǎn)生450nm熒光的熒光強(qiáng)度達(dá)到240時的時間，建立大腸埃希氏菌菌懸液濃度和特征時間的線性方程；

步驟2、將待測水樣濃縮，加入步驟1所述檢測培養(yǎng)液培養(yǎng)，在其410nm吸光度有明顯變化的前提下，記錄待測水樣特征時間，將其代入到步驟1中的線性方程中獲得待測水樣中大腸埃希氏菌的濃度；

其中，所述檢測培養(yǎng)液包括Tryptone、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銨、氯化鈉、氯化鈣、亞硫酸鈉、吐溫-80、NaH₂PO₄·H₂O、K₂HPO₄·3H₂O、鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷、4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷、3號膽鹽。