[發明專利]用于天然彩色新品種蠶鑒定的絲蛋白肽段及其制備方法

在審

• 申請號: 201410353375.6
• 申請日: 2014-07-23
• 公開（公告）號: CN104232665A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發明（設計）人: 王建南;裔洪根;褚永興
• 申請（專利權）人: 湖州南潯恒岳農業科技有限公司
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C07K19/00;C07K1/22
• 代理公司: 杭州新源專利事務所(普通合伙) 33234
• 代理人: 李大剛

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種用于蠶品種鑒定抗體制備的絲蛋白肽段(抗原)及其制備方法。

背景技術

蠶絲絲素(以下簡稱絲素)蛋白屬于天然動物蛋白纖維，是一種結構蛋白，由結晶態和無定形態兩大部分組成。絲素蛋白包括家蠶絲和野蠶絲(柞蠶絲、天蠶絲等)。家蠶絲素是重鏈(H鏈)蛋白、絲素輕鏈(L鏈)蛋白和糖蛋白P25三個部分組成的復合體，柞蠶絲、天蠶絲絲素由H鏈組成。

家蠶絲素由于來源豐富，數十年來也是研究的熱點，學者對其結構、性能及生物材料應用方面進行了大量的研究，然而，有關野蠶絲素方面的研究國內外報道極少，如天蠶絲素、柞蠶絲素等天然彩色絲素。天蠶絲、柞蠶絲是天然彩色蠶絲的代表，天然彩色絲是一種綠色產品，對減少環境污染，促進人類健康非常有利。具有天然淡黃色的柞蠶絲在日本市場及歐洲市場上極受歡迎。目前，國際市場的天然有色昆蟲絲十分緊缺，以黃色野蠶絲為例，價格是白色蠶絲的3-30倍。天然彩色黃繭或綠繭繭絲中含有的黃酮類化合物，來自于食用的桑葉，因此不僅具有白色蠶絲良好的吸濕性、放濕性、保暖性和透氣性絲，還具有良好的抑菌功效和抗氧化的阻擋紫外線的功能，能有效地防止因環境污染引起人體內發生氧化作用所造成的危害。除此，天蠶絲素、柞蠶絲素等天然彩色絲素蛋白肽鏈上含有一種特殊的序列：精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(RGD)三肽序列，這種RGD三肽序列廣泛存在于膠原蛋白、粘著蛋白等細胞外基質中，有助于細胞粘附，促使帖壁細胞粘附生長，可以作為醫療領域組織修復選用的最佳材料之一。因此，選育彩色繭實用品種，并及時進行大規模生產開發，具有非常誘人的商業前景，將大大推動新型蠶品種的開發力度和開拓蠶絲業發展的新局面。

但由于天蠶、柞蠶等天然彩色繭蠶品種難以飼養，蠶絲來源比較稀少，所以應用極其稀少，而且目前我們研究的天然黃色家蠶絲的色素主要存在于絲膠中。

已經研究證實天蠶、柞蠶等天然彩色絲的色素來自于桑葉，而且攝入家蠶體內的黃酮物質是否能夠從消化管進入血液、從血液進入絲腺，受到消化管和絲腺上皮細胞的透過性影響，即受到色素生成及運輸的基因的控制。目前已有多種色繭基因已被鑒定，我們將在分子育種時可以導入繭色相關基因，培育出具有穩定遺傳的色素生成及運輸控制基因的蠶品種，使合成與分泌的蠶絲具有天然色素。另外色繭基因一經鑒定，可以通過分子生物學技術克隆可能的相關基因進行遺傳雜交品種的篩選，選育出理想的天然彩色繭蠶品種，制備不含任何化學成分的來自于天然植物并在蠶體內經修飾過的天然彩色蠶絲—新世紀的綠色纖維及其產品。

研究開發基于白色絲家蠶和柞蠶、天蠶等天然彩色絲等品種蠶的優良易飼養、穩定遺傳的天然彩色家蠶品種，品種育成后，我們必須對其產品(繭絲)進行分子鑒定，以確定合成與分泌的蠶絲具有雜交優勢的蛋白質，但目前還沒有方法能從分子水平上進行鑒定。

發明內容

針對目前的研究現狀，本發明主要解決的技術問題是提供一種用于天然彩色蠶品種鑒定抗體制備的絲蛋白肽段及其制備方法，通過對白色繭絲的家蠶和天然彩色繭絲的柞蠶、天蠶等絲素蛋白基因的分析，克隆了源于蠶新品種親本的典型的肽段基因序列，包括家蠶絲H鏈非結晶區基因、H鏈結晶區與非結晶區的重組基因；柞蠶、天蠶蠶絲H鏈基因；構建了大腸桿菌表達載體，獲得了相應肽段的表達產物(蠶絲蛋白肽段-用于抗體制備相應的抗原)。獲得的產物用于進一步制備高精確度的蠶絲抗體。

為解決上述技術問題，本發明采用的一個技術方案是：

一種用于天然彩色蠶品種鑒定抗體制備的絲蛋白肽段，其基因序列包括家蠶絲H鏈非結晶區基因、H鏈結晶區與非結晶區的重組基因以及天然彩色繭柞蠶、天蠶蠶絲H鏈基因。

所述的家蠶絲H鏈非結晶區基因的非重復序列肽段的編碼基因序列為SGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFAG。

所述的天蠶絲素蛋白重鏈氨基酸編碼基因序列為SGAGGRGDGGYGSGSSG(-RGD-)。

所述的絲蛋白肽段的制備方法，具體包括家蠶品種蠶絲非結晶區基因的克隆、表達載體構建與表達，家蠶品種蠶絲結晶區與非結晶區重組基因的克隆、表達載體構建與表達，天然彩色繭品種蠶絲基因的克隆、表達載體構建與與表達。

一、家蠶品種蠶絲非結晶區基因的克隆、表達載體構建與表達，包括以下步驟：