[發明專利]用于天然彩色新品種蠶鑒定的絲蛋白肽段及其制備方法

在審

• 申請號: 201410353375.6
• 申請日: 2014-07-23
• 公開（公告）號: CN104232665A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發明（設計）人: 王建南;裔洪根;褚永興
• 申請（專利權）人: 湖州南潯恒岳農業科技有限公司
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C07K19/00;C07K1/22
• 代理公司: 杭州新源專利事務所(普通合伙) 33234
• 代理人: 李大剛

1.用于天然彩色新品種蠶鑒定的絲蛋白肽段，其特征在于，其基因序列包括家蠶絲H鏈非結晶區基因、H鏈結晶區與非結晶區的重組基因以及天然彩色繭蠶柞蠶、天蠶蠶絲H鏈基因片段。

2.根據權利要求1所述的絲蛋白肽段，其特征在于，所述的家蠶絲H鏈非結晶區基因構建的表達載體為pGEX-F(1)，所述的H鏈結晶區與非結晶區的重組基因構建的表達載體為pGEX-gs16f1，所述的天然彩色繭蠶柞蠶、天蠶蠶絲H鏈基因片段的表達載體為pGEX-AYR4。

3.一種制備如權利要求1或2所述的絲蛋白肽段的方法，其特征在于，包括家蠶品種蠶絲非結晶區基因的克隆、表達載體構建與表達，家蠶品種蠶絲結晶區與非結晶區重組基因的克隆、表達載體構建與表達，天然彩色繭品種蠶絲基因的克隆、表達載體構建與表達。

4.如權利要求3所述的絲蛋白肽段的制備方法，其特征在于，所述的家蠶品種蠶絲非結晶區基因的克隆、表達載體構建與表達，包括以下步驟：

A、對Invitrogen公司合成的家蠶品種蠶絲非結晶區基因的非重復序列肽段F(1)的編碼基因序列，基因序列的一端設計有限制性核酸內切酶HindIII-NgoMIV位點，另一端設計有AgeI-BglII位點，用已經保存的含多克隆位點的基礎質粒來完成非結晶區基因序列的克隆，用限制性核酸內切酶BglII/HindIII消化pSLFA1180FA，插入設計合成的含有BglII和HindIII的粘末端非結晶區基因序列，T4DNA連接酶連接后得到含有完整非結晶區編碼基因的質粒pSL-F(1)；

B、由pGEX-KG經過改造加入限制性核酸內切酶AgeI位點得pGEX-AgeI，AgeI/HindIII酶切的pGEX-AgeI載體回收載體片段，AgeI/HindIII酶切質粒回收插入片段，T4DNA連接酶連接構建含有非結晶區肽段基因的表達載體表示為pGEX-F(1)；

C、將構建的表達載體pGEX-F(1)轉入大腸桿菌BL21菌細胞，加入0-1.2mM的誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳苷糖(IPTG)，在37度轉速200rpm/min的空氣搖床中誘導培養0-8小時，然后用4100rpm/min的速度離心收集表達GST融合蛋白的BL21菌細胞；

D、菌細胞用適量的磷酸鹽緩沖液重懸，置于冰上超聲破碎后13300r/min的速度離心10min，收集上清液；

E、將超聲破碎后收集的上清液用GST親和層析柱純化，獲得了純度較高的融合蛋白GST-F(1)；

F、采用葡聚糖G-50分子篩去除GST親和層析過程中的還原型谷胱甘肽后，融合蛋白經凝血酶酶切，再經GST親和層析柱純化獲得設計所需要的源于家蠶蠶絲蛋白的多肽F(1)。