[發明專利]一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉化方法

有效

• 申請號: 201410353144.5
• 申請日: 2014-07-23
• 公開（公告）號: CN104140978B
• 公開（公告）日: 2017-02-15
• 發明（設計）人: 王躍華;任三軍;孫雁霞
• 申請（專利權）人: 成都大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 四川君士達律師事務所51216
• 代理人: 芶忠義

技術領域

本發明涉及山葵遺傳轉化技術領域，特別公開一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉化方法。

背景技術

山葵(Wasabi?japonica?Matsum)又名山崳菜、山菜，為十字花科山崳菜屬多年生半陰生草本植物。山葵植物中含有一種芥子苷類的物質，在植物體被磨碎時，該物質在芥子苷酶的作用下水解形成異硫氰酸酯類化合物，其中尤以丙烯基異硫氰酸酯含量最高，約占89％～94％；另外，山葵植物還含有大量的氨基酸和各種人體需要的微量元素。由于山葵含有豐富的異硫氰酸酯類化合物和大量的人體需要的氨基酸和微量元素，其不僅具有強烈的辛辣味和特殊的香辛味，而且還具有免疫調節、抗菌、抗癌、抗氧化、抗血小板聚集等多種作用，是國際上公認的極為稀缺和珍貴的藥食同源植物，被稱為“綠色黃金”。

與其廣泛的應用形成鮮明的對比，山葵資源十分有限，這是因為山葵植物的生長發育對環境有極為苛刻的要求，山葵適于在海拔高度為1000～2000米、溫度范圍為8～l8℃的潮濕涼爽的林中小溪生長。山葵生育溫度一旦超過30℃易發生軟腐病、黑心病、白粉病和病毒病，其中以軟腐病和黑已病最為嚴重；但低于-3℃時又易受凍害；另外，山葵結實率低，種子休眠期長，其栽培地也不能連續種植；通常一株山葵植物經過18個月的栽種，收獲的根莖平均不到200g。因此，目前僅靠山葵有限的栽種量，是遠不能滿足市場的需求。

專利CN1204453A公開了一種山葵種苗的快速繁殖方法，包括：無菌條件下切取山葵頂芽或根狀莖上的側芽，通過對培養基的選擇、激素配比、培養條件的改變，進行試管苗誘導、試管苗的快速增殖培養、試管苗壯苗培養、生根培養、馴化移栽使山葵組培苗的增殖迅速，其繁殖系數能達到4.0-5.0，增殖培養形成的試管苗直接用于生產，省工省力、省地、速度快、降低生產成本。專利CN102668992A公開了一種山葵組培苗瓶外生根方法，其利用組織培養誘導山葵莖尖獲得無根試管芽苗，在繼代培養后，將芽苗經馴化切成單芽，再將芽苗插入土壤基質中，期間每周澆促根劑及1/2MS營養液一次，插入土壤基質30d后可獲得較好的生根效果。專利CN102823491A公開了一種以山葵根為外植體的山葵愈傷組織培養方法，包括如下步驟：(1)外植體的處理：取從山葵植株剪下的山葵根，用流水沖洗干凈后，放于濾紙上吸干表面水分，然后將其放在超凈工作臺上用濃度為0.1％～0.15％的升汞消毒5～8min，再用無菌水沖洗2～5次后用已滅菌的濾紙吸干表面的水分；(2)愈傷組織的誘導培養：將已消毒的山葵根切為1-2cm的長度，然后接入愈傷組織培養基MS+6-BA0.5～4.0mg·L^-1+2,4-D-1.0～6.0-mg·L^-1+IAA0.5～3.0mg·L^-1中進行誘導培養，培養條件為：溫度10～28℃，每天光照4～10小時，光照強度為600～1200lx；(3)愈傷組織的增殖培養：將步驟(2)制得的愈傷組織轉接入愈傷組織增殖培養基1/2MS+6-BA0～1.0mg·L^-1+2,4-D1.0～4.0mg·L^-1+KT0.5～1.0mg·L^-1+硫代硫酸鈉0.5～4.0g·L^-1中進行增殖培養，培養條件為：溫度10～28℃，每天光照6～12小時、光照強度為800～1500lx；上述所有培養基的pH值為5.6～6.5、蔗糖15～30g·L^-1、瓊脂5.0～6.0g·L^-1。其通過將山葵根作為外植體接入愈傷組織培養基中進行培養，成功誘導出了有效成分含量高的山葵愈傷組織。專利CN103053426A公開了一種山葵幼苗培養方法，包括以下步驟：(A)生根培育：將經過滅菌脫毒初代培育的莖尖分生組織轉移到不加激素的1/2MS培養基中生長；(B)移栽煉苗：步驟(A)持續28～32天后，將其移入到穴盤中；(C)大田種植：步驟(B)移栽煉苗75～85天后，將成品山葵幼苗移栽至大田。其采用在增殖培養的培養基中添加生根劑的方式來代替細胞分裂素，克服了生根較慢、根細長的問題，達到了短期內迅速增加單株苗的根長度的目的。專利CN103718963A公開了一種山葵脫毒苗的培養方法，其選用無菌的山葵芽體為培養材料，經變溫處理后，取其芽分生組織接入叢生芽分化培養基中，再經壯苗培養基和生根培養基的誘導培養而獲得山葵脫毒苗，所培養的山葵脫毒苗具有生長速度快、有效組分含量高等優點。