[發明專利]一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉化方法

有效

• 申請號: 201410353144.5
• 申請日: 2014-07-23
• 公開（公告）號: CN104140978B
• 公開（公告）日: 2017-02-15
• 發明（設計）人: 王躍華;任三軍;孫雁霞
• 申請（專利權）人: 成都大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 四川君士達律師事務所51216
• 代理人: 芶忠義

1.一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉化方法，其特征在于包括如下步驟：

步驟1，農桿菌菌種的活化培養：將發根農桿菌在YEB固體培養基上劃線后，放在26～30℃的溫度條件下進行暗培養24～36h后，挑取單菌落接入YEB液體培養基中，并于25～30℃振蕩培養1～2天后，用于外植體浸染；

步驟2，山葵無菌苗的獲得：將山葵種子放在超凈工作臺上，先用75％的酒精消毒20～40s，再用0.1％升汞消毒3～8min，無菌水沖洗2～5次后，剝去種皮接種在培養基上培養，獲得山葵無菌苗；

步驟3，山葵子葉的預培養：切取山葵無菌苗展開的子葉作為外植體，接種于預培養基上，并進行預培養；

步驟4，山葵子葉的遺傳轉化：選取預培養后的山葵子葉外植體放入步驟(1)活化好的農桿菌菌液中浸染，使外植體與農桿菌充分接觸后，并用無菌濾紙吸干外植體表面多余的菌液后，再轉入共培養基中，在15～22℃的暗培養條件下進行1～3d的共培養；隨后將其轉入抗生素水中浸泡后，再轉入除菌培養基中進行除菌培養，每隔2～4d轉接一次除菌培養基，直到毛狀根大量產生；

步驟5，山葵毛狀根的快速增殖：切取長度為1.5～3cm的毛狀根轉接在毛狀根快速增殖培養基中培養。

2.根據權利要求1所述的一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉化方法，其特征在于：步驟(1)中采用的農桿菌為發根農桿菌A4或R1000，浸染山葵子葉外植體的菌液OD₆₀₀＝0.1～0.3。

3.根據權利要求1所述的一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉化方法，其特征在于：步驟(2)中將消毒后的山葵種子剝去種皮并接種在MS+6-BA0.5～4mg·L^-1+NAA(或者IAA)0.5～2mg·L^-1+蔗糖20～50g·L^-1+瓊脂3.5～4.5g·L^-1的培養基上，并在22～28℃，光強1000～2000lx,每天光照8～12h的條件下培養，獲得山葵無菌苗。

4.根據權利要求1所述的一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉化方法，其特征在于：步驟(3)中，是選取山葵無菌苗剛展開1-4d的子葉作為外植體。

5.根據權利要求1所述的一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉化方法，其特征在于：步驟(3)中，預培養基是MS+2，4-D1～2mg·L^-1+KT0.1～0.5mg·L^-1+腺嘌呤10～20mg·L^-1+蔗糖20～50g·L^-1+瓊脂5～7g·L^-1。

6.根據權利要求1所述的一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉化方法，其特征在于：步驟(3)中，山葵子葉的預培養條件是在18～22℃、無光照條件下進行1～3d的預培養。

7.根據權利要求1所述的一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉化方法，其特征在于：步驟(4)中是選取預培養后在山葵子葉切口處產生膨大的外植體放入活化好的農桿菌菌液中浸染1～3分鐘。

8.根據權利要求1所述的一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉化方法，其特征在于：步驟(4)中的共培養基為1/2MS+鄰苯二酚100～200mg·L^-1+蔗糖10～15g·L^-1+瓊脂4～5.5g·L^-1；并在15～22℃的暗培養條件下進行1～3d的共培養。

9.根據權利要求1所述的一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉化方法，其特征在于：步驟(4)中，把共培養后的外植體轉入含頭孢噻肟鈉200～500mg·L^-1的抗生素水中浸泡1～3小時后，再轉入除菌培養基為1/2MS+IBA0.1～0.5mg·L^-1+瓊脂5～7g·L^-1+蔗糖15～30g·L^-1+頭孢噻肟鈉200～400mg·L^-1+頭孢曲松鈉200～400mg·L^-1中進行除菌培養。

10.根據權利要求1所述的一種以山葵子葉為外植體的遺傳轉化方法，其特征在于：步驟(5)中，毛狀根快速增殖培養基為1/2MS+IBA0.1～0.5mg·L^-1+蔗糖10～20g·L^-1+頭孢霉素100～300mg·L^-1的液體培養基上進行毛狀根的快速增殖培養。