[發明專利]一種測定水產品中的孔雀石綠酶聯免疫吸附法

在審

• 申請號: 201410353133.7
• 申請日: 2014-07-24
• 公開（公告）號: CN105277692A
• 公開（公告）日: 2016-01-27
• 發明（設計）人: 洪霞;鄧榕榕;杜霞
• 申請（專利權）人: 江蘇維賽科技生物發展有限公司
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/535
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

孔雀石綠(MG)是一種三苯甲烷類工業染料，常用于制陶、紡織、皮革、食品顏色劑和細胞化學染色劑等?。也可用作驅蟲劑、殺蟲劑、防腐劑，是藥用染料中抗菌效力較強的一類，用于預防與治療各類水產動物的水霉病、鰓霉病和小瓜蟲病等。近年來發現孔雀石綠(MG)特別是其代謝產物無色孔雀石綠(LMG)在水產動物體內有明顯的蓄積殘留現象，而其化學官能團三苯甲烷是一類致癌物質，食用經MG治療的水產品后，免疫系統和繁殖系統受到較大的影響，具體地說是一種水產品中孔雀石綠含量的檢測方法。

背景技術

目前已發現可以致癌的化合物約有450余種，孔雀石綠，三苯甲烷類工業染料，是一種重要的化學致癌物，使用被其污染的水體，對人體健康有很大的威脅。測定食品及環境中孔雀石綠及其代謝物常用高效液相色譜法。采用二氧化鉛衍生柱進行柱前或柱后氧化，將無色孔雀石綠氧化為孔雀石綠后進行檢測，或者利用HPLC一熒光檢測法直接檢測魚肉組織中的無色孔雀石綠。雖然這些方法的準確度較高，但儀器昂貴、樣品預處理復雜、費時、檢測成本高。為了確保動物食品安全，避免孔雀石綠對水生物及人體健康的危害，有必要建立對水產動物中孔雀石綠殘留監測的靈敏、快速的分析方法。本文自制無色孔雀石綠完全免疫抗原和無色孔雀石綠多克隆抗體，經過實驗條件的篩選和優化，建立了測定孔雀石綠和無色孔雀石綠的酶聯免疫吸附分析法，并用于真實樣品的測定。

發明內容

本發明針對上述問題，提供一種水產品中孔雀石綠含量的檢測方法，該方法可快速、簡便、準確地定量檢測孔雀石綠的含量。

按照本發明的技術方案：一種水產品中孔雀石綠含量的檢測方法，包括以下步驟：

(1)溶液的配制

a.包被液的配制：將碳酸鈉、碳酸氫鈉配制成pH7.0-8.0的溶液，低溫保存；

b.洗滌液的配制：將氯化鈉、十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀及吐溫20配制成pH7-8的溶液，低溫保存；

c.終止液的配制：配制10-15％的濃硫酸；

d.封閉液的配制：將氯化鈉、十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、吐溫20及牛血清白蛋白配制成pH7-8的溶液，低溫保存；

e.底物溶液的配制：將磷酸氫二鈉、檸檬酸、H₂O₂及四甲基聯苯胺配制成溶液。

(2)抗體固定

將孔雀石綠多克隆抗體用包被液稀釋，以每孔100μL加入酶標板中，同時設立正常血清稀釋液的陽性對照，低溫過夜保存；

將孔中液體倒盡，加入洗滌液，保留3min，再倒盡，如此重復洗滌多次；每孔中添加100μL封閉液，37℃，保留1h；

將孔中液體倒盡，加入洗滌液，保留3min，再倒盡，如此重復洗滌多次.

(3)免疫反應

用封閉液稀釋待測樣品溶液后加入酶標板孔中，100μL/孔，37℃，保留1-2h，孔中液體倒掉，加入洗滌液，保留3min，倒盡，如此重復洗滌多次；

用封閉液稀釋酶標孔雀石綠溶液后加入孔中，100μL/孔，37℃，保留1-2h，孔中液體倒掉，加入洗滌液，保留3min，倒盡，如此重復洗滌多次；

加入底物溶液，100μL/孔，避光，37℃，10-15min；加入終止液終止反應，100μL/孔。

(4)檢測信號的獲得

用酶標儀檢測酶標板孔中的液體OD值，根據OD值判斷樣品中孔雀石綠的含量，根據孔雀石綠含量的標準曲線可計算出樣品中孔雀石綠的含量大小。

所述重復洗滌的次數為三次；所述低溫為4℃。

本發明的技術效果在于：本發明結合競爭酶聯免疫吸附法的特點對水產品中的孔雀石綠含量進行檢測，靈敏度高、干擾小、簡便、快速、操作安全、無污染、特異性強，測試成本低。

附圖說明

圖1是酶聯免疫測定孔雀石綠的標準曲線。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步的說明。

如圖1所示，本發明是一種水產品中孔雀石綠含量的檢測方法，包括以下步驟：

(1)溶液的配制

a.包被液的配制：將碳酸鈉、碳酸氫鈉配制成pH7.0-8.0的溶液，低溫保存；

b.洗滌液的配制：將氯化鈉、十二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀及吐溫20配制成pH7-8的溶液，低溫保存；

c.終止液的配制：配制10-15％的濃硫酸；