[發明專利]檢測阿德呋啉的時間分辨熒光免疫試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201410352357.6
• 申請日: 2014-07-23
• 公開（公告）號: CN105301246A
• 公開（公告）日: 2016-02-03
• 發明（設計）人: 洪霞;薛永來;杜霞
• 申請（專利權）人: 江蘇維賽科技生物發展有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/533
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物檢測領域，具體的說，涉及一種檢測阿德呋啉的時間分辨熒光免疫分析試劑盒及其檢測方法。

背景技術

阿德呋琳屬核苷酸類化合物，英國科學家在上個世紀七十年代有相關研究報道，在我國是一種正在研發的新型高效抗球蟲藥物。阿德呋啉針對球蟲有良好的治療效果，其抗球蟲指數ACI為183.2。將一定量的阿德呋啉藥物飼養羅曼雄性雛雞，可明顯檢測到雞肝和雞腎中阿德呋啉以原藥形式存在。以昆明種健康小氣考察阿德呋啉的急性毒性試驗，口服給藥，給藥一次或24h內多次給藥后，一定時間內所產生的毒性反應及死亡過程得出阿德呋啉LD₅₀為3443.5mg?Kg^-1?bw^-1最高劑量給藥后，小鼠精神沉郁、呼吸急促。剖檢部分死亡小鼠發現腹腔液較多，藥物吸收不完全，脾臟腫大。目前在家禽等動物中都沒有阿德呋琳的相關研究報道，為了完成新獸藥申報，建立阿德呋啉藥物的安全評價，保障食品安全，所以開展阿德呋啉的檢測研究。

近年來，水、食品安全、衛生、公共健康和能源等與大眾的生活息息相關的問題，也越來越受到全球的關注，見附錄1。世界各國針對食品安全問都幵展研究解決辦法。歐盟從2006年1月1日起開始執行新的食品安全法規，其中特別要求進口食品必須符合新法規的標準，否則歐盟委員會有權取消其進口資格。隨著獸藥在畜禽詞養過程中的長期大量使用，防止濫用藥物具有重要意義。在西方經濟發達的國家，人們十分重視獸藥殘留的監控，頒布了一系列畜產品中獸藥殘留限量標準和管理法規，嚴格實施對畜產品中獸藥殘留的監督、監控與檢測，制定了詳盡的獸藥殘留檢測方法。

而時間分辨熒光免疫分析法（TR-FIA）由于其特異性強、靈敏度高、操作簡單、廉價，且特別適于大批量樣品的檢測等優點而越來越被人們所重視和采用。目前還沒有針對阿德呋啉檢測的時間熒光免疫分析法的專利和文獻報道。

發明內容

為解決以上技術問題，本發明的目的在于提供一種蔬菜水果中阿德呋啉殘留的檢測時間分辨熒光免疫分析試劑盒。

本發明的目的之二在于提供一種快速簡便地檢測蔬菜水果中阿德呋啉的時間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測方法，用于定量或定性地檢測蔬菜水果中阿德呋啉殘留量。

本發明目的之一是這樣實現的：檢測阿德呋啉的時間分辨熒光免疫分析試劑盒，其關鍵在于由多孔包被板、緩沖液、阿德呋啉標準品溶液、抗阿德呋啉的抗體凍干品、銪標記的兔抗鼠抗體、洗滌液和增強液體所組成。

本發明目的之二是這樣實現的：檢測阿德呋啉的時間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測方法，包括免疫原、包被原和單克隆抗體的制備以及樣品前處理及檢測，其關鍵在于：

(1)免疫原的制備：將半抗原阿德呋啉與牛血清白蛋白（BSA）偶聯，得到免疫原（阿德呋啉-BSA）；

(2)包被原的制備：將半抗原阿德呋啉與卵血清白蛋白（OVA）偶聯，得到包被原（阿德呋啉-OVA）；

(3)單克隆抗體的制備：

a.用步驟(1)的免疫原（阿德呋啉-BSA）免疫小鼠，通過雜交瘤技術，得到分泌抗阿德呋啉的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；

b.以體內誘生腹水法大量制備抗體，使用ProteinG柱進行純化，獲得抗阿德呋啉的單克隆抗體IgG；

c.用步驟(2)的包被原包被96孔包被板；

(4)樣品的前處理及檢測：

取包被有包被原（阿德呋啉-OVA）的多孔包被板，加入50μL的阿德呋啉到各自的微孔中，加50μL以緩沖液稀釋的抗阿德呋啉抗體，25℃～37℃振蕩0.5~1小時，洗滌液洗3次，加以緩沖液稀釋的100μLEu³⁺-兔抗鼠抗體，25℃～37℃振蕩0.5~1

小時，洗滌液洗6次，加200μL增強液振蕩5分鐘后測量熒光強度cps，根據標準曲線計算樣品中的阿德呋啉含量。

上述的固相載體是多孔包被板，采用96孔的多孔包被板作為固相載體。

本發明主要采用時間分辨熒光免疫分析方法來檢測阿德呋啉。采用時間分辨熒光免疫分析法的技術主要有兩個方面：第一，特異性單克隆抗體制備，用偶聯的免疫原免疫小鼠，通過雜交瘤技術，得到分泌抗阿德呋啉的單克隆抗體的雜交瘤細胞株；以體內誘生腹水法大量制備抗體，使用ProteinG柱進行純化，獲得抗阿德呋啉的單克隆抗體IgG。第二，Eu³⁺標記抗體的制備。