[發(fā)明專利]一種鏈霉菌基因組DNA大片段體內(nèi)隨機(jī)敲除的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410351442.0
• 申請日: 2014-07-23
• 公開（公告）號: CN104109688B
• 公開（公告）日: 2017-03-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 路志群;邢述永;李文雪;鄧自發(fā)
• 申請（專利權(quán)）人: 南通大學(xué)
• 主分類號: C12N15/76
• 分類號: C12N15/76
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙)32249
• 代理人: 徐激波

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種鏈霉菌基因組DNA大片段體內(nèi)隨機(jī)敲除的方法。

背景技術(shù)

鏈霉菌屬于高GC含量的革蘭氏陽性細(xì)菌，是放線菌中的一個大的類群。鏈霉菌具有復(fù)雜的發(fā)育和分化周期，在固體培養(yǎng)基上呈絲狀生長并產(chǎn)生孢子。鏈霉菌屬的不同種中鑒定了約6000種抗生素和生理活性物質(zhì)，占已報道的微生物來源藥物的約一半（Berdy?J.?2005.?Bioactive?microbial?metabolites.?J?Antibiot?(Tokyo)?58(1):1-26）。天藍(lán)色鏈霉菌是鏈霉菌研究的模式菌株，遺傳背景研究相對清晰。2002年，天藍(lán)色鏈霉菌完成全基因組測序（Bentley?S.?D,?K.?F.?Chater,?A.?M.?Cerdeno-Tarraga,?G.?L.?Challis,?N.?R.?Thomson,?K.?D.?James,?D.?E.?Harris,?M.?A.?Quail,?H.?Kieser,?D.?Harper,?A.?Bateman,?S.?Brown,?G.?Chandra,?C.?W.?Chen,?M.?Collins,?A.?Cronin,?A.?Fraser,?A.?Goble,?J.?Hidalgo,?T.?Hornsby,?S.?Howarth,?C.?H.?Huang,?T.?Kieser,?L.?Larke,?L.?Murphy,?K.?Oliver,?S.?O'Neil,?E.?Rabbinowitsch,?M.?A.?Rajandream,?K.?Rutherford,?S.?Rutter,?K.?Seeger,?D.?Saunders,?S.?Sharp,?R.?Squares,?S.?Squares,?K.?Taylor,?T.?Warren,?A.?Wietzorrek,?J.?Woodward,?B.?G.?Barrell,?J.?Parkhill,?and?D.?A.?Hopwood.?2002.?Complete?genome?sequence?of?the?model?actinomycete?Streptomyces?coelicolor?A3(2).?Nature?417:141-147.），目前已經(jīng)開發(fā)出商用的DNA芯片檢測平臺，可以對染色體水平的差異進(jìn)行即時快速地分析。

構(gòu)建基因缺失突變是研究微生物生理及基因功能的常用方法。由于鏈霉菌生長慢，常規(guī)的基因敲除方法耗時較長，不適合大規(guī)模基因缺失突變研究。轉(zhuǎn)座子插入突變是一個相對快速有效的基因失活方式，可以很快建立一個覆蓋全基因組的基因插入失活突變庫。轉(zhuǎn)座子插入缺失可以大致分為體內(nèi)體外兩種。2001年，Gehring等報道利用Tn5轉(zhuǎn)座子對已有的天藍(lán)色鏈霉菌基因組文庫進(jìn)行隨機(jī)插入突變，建立了一個以大腸桿菌為宿主的突變文庫，抽提突變文庫后使用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和接合轉(zhuǎn)移等手段轉(zhuǎn)入天藍(lán)色鏈霉菌M145中，抗性篩選雙交換后得到了一個在基因組上隨機(jī)插入的突變庫，平板篩選得到5個帶有明顯表型變化的突變株，發(fā)現(xiàn)了一些調(diào)控基因（Gehring?A.?M.,?Nodwell?J.?R.,?Beverley?S.?M.,?Losick?R.?2000.?Genomewide?insertional?mutagenesis?in?Streptomyces?coelicolor?reveals?additional?genes?involved?in?morphological?differentiation.?Proc?Natl?Acad?Sci?U?S?A?97(17):9642-7.）。隨后的2004年，他們用相同的方法又發(fā)現(xiàn)了另外一些生物合成相關(guān)的酶影響了天藍(lán)色鏈霉菌M145的表型（Gehring?A.?M.,?Wang?S.?T.,?Kearns?D.?B.,?Storer?N.?Y.,?Losick?R.?2004.?Novel?genes?that?influence?development?in?Streptomyces?coelicolor.?J?Bacteriol.?186(11):3570-7.）。該方法可以做到基因組范圍內(nèi)的隨機(jī)突變，但是轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座突變過程在大腸桿菌內(nèi)完成，仍需要將突變子從大腸桿菌導(dǎo)入鏈霉菌中，影響了效率。