[發明專利]一種鏈霉菌基因組DNA大片段體內隨機敲除的方法

有效

• 申請號: 201410351442.0
• 申請日: 2014-07-23
• 公開（公告）號: CN104109688B
• 公開（公告）日: 2017-03-01
• 發明（設計）人: 路志群;邢述永;李文雪;鄧自發
• 申請（專利權）人: 南通大學
• 主分類號: C12N15/76
• 分類號: C12N15/76
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標事務所(普通合伙)32249
• 代理人: 徐激波

1.一種鏈霉菌基因組DNA大片段體內隨機敲除的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）構建系列重組質粒pTNL_101或pTNL_103或pTNL_104或pTNL_105為第一個SceS酶切位點隨機導入質粒，各質粒中轉座酶編碼序列之前分別帶有ermE啟動子、neo啟動子、hrdB基因啟動子和tcp830誘導型啟動子；

2）將所構建的重組質粒pTNL_101或pTNL_103或pTNL_104或pTNL_105導入天藍色鏈霉菌M145，構建隨機染色體大片段缺失的突變子庫tn1；

3）構建系列重組質粒pTNL_102為第二個SceS酶切位點隨機導入質粒，導入突變子庫1，獲得突變子庫tn2；

4）利用大腸桿菌ET12567導入重組質粒pLu_101至突變子庫tn2，通過硫鏈絲菌素誘導表達歸巢核酸內切酶SceS，酶切染色體上隨機導入的SceS酶切位點，促進染色體上隨機導入的兩個重疊的不完整的卡那霉素抗性基因片段發生重組，去除之間的染色體片段，通過涂布卡那霉素的方式篩選得到轉座子突變子庫tn3；

5）利用R₂YE平板評估大片段敲除突變子或利用質粒挽救的方法精細定位染色體刪除區段。

2.根據權利要求1所述的鏈霉菌基因組DNA大片段體內隨機敲除的方法，其特征在于：步驟1）中，所述的重組質粒pTNL_101以pDZY101為模板，PCR帶有整合酶、ermE啟動子、IRR、oriT、阿普拉霉素抗性基因片段和oriC的片段，在重組質粒pTNL_101上克隆入帶有sceS酶切位點的不完整的卡那霉素抗性基因片段，所述的不完整的卡那霉素抗性基因片段序列如SEQ?ID?NO1所示。

3.根據權利要求1所述的鏈霉菌基因組DNA大片段體內隨機敲除的方法，其特征在于：步驟1）中，所述的重組質粒pTNL_103以pDZY101為模板，PCR帶有整合酶、neo啟動子、IRR、oriT、阿普拉霉素抗性基因片段和oriC的片段，在重組質粒pTNL_101上克隆入帶有sceS酶切位點的不完整的卡那霉素抗性基因片段，所述的不完整的卡那霉素抗性基因片段序列如SEQ?ID?NO1所示。

4.根據權利要求1所述的鏈霉菌基因組DNA大片段體內隨機敲除的方法，其特征在于：步驟1）中，所述的重組質粒pTNL_104以pDZY101為模板，PCR帶有整合酶、hrdB基因啟動子、IRR、oriT、阿普拉霉素抗性基因片段和oriC的片段，在重組質粒pTNL_101上克隆入帶有sceS酶切位點的不完整的卡那霉素抗性基因片段，所述的不完整的卡那霉素抗性基因片段序列如SEQ?ID?NO1所示。

5.根據權利要求1所述的鏈霉菌基因組DNA大片段體內隨機敲除的方法，其特征在于：步驟1）中，所述的重組質粒pTNL_105以pDZY101為模板，PCR帶有整合酶、tcp830誘導型啟動子、IRR、oriT、阿普拉霉素抗性基因片段和oriC的片段，在重組質粒pTNL_101上克隆入帶有sceS酶切位點的不完整的卡那霉素抗性基因片段，所述的不完整的卡那霉素抗性基因片段序列如SEQ?ID?NO1所示。

6.根據權利要求1所述的鏈霉菌基因組DNA大片段體內隨機敲除的方法，其特征在于：步驟3）中，所述的重組質粒pTNL_102以pDZY101為模板，PCR帶IRR和oriC的片段，隨后克隆入帶有oriT的壯觀霉素抗性基因，最后克隆入帶有sceS酶切位點的不完整的卡那霉素抗性基因片段，所述的不完整的卡那霉素抗性基因片段序列如SEQ?ID?NO2所示。

7.根據權利要求1所述的鏈霉菌基因組DNA大片段體內隨機敲除的方法，其特征在于：步驟4）中，所述的質粒挽救的方法精細定位染色體刪除區段，具體過程為：限制性內切酶ApaⅠ在天藍色鏈霉菌染色體上分布均勻，利用該酶酶切染色體后自連轉化大腸桿菌，抗性篩選大腸桿菌并抽提質粒，測序即能精確定位敲除區段。