[發明專利]對細胞基因組的預定位點進行基因改造的方法

在審

• 申請號: 201410346231.8
• 申請日: 2014-07-18
• 公開（公告）號: CN104152414A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 李卓;裴端卿
• 申請（專利權）人: 中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/09;C12N15/63
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體的，本發明涉及重組細胞、用于對細胞進行基因改造的試劑以及對細胞基因組的預定位點進行基因改造的方法。

背景技術

CRISPR(Clustered?Regularly?Interspaced?Short?Palindromic?Repeats)/Cas9是近兩年被廣泛認可的由RNA指導Cas核酸酶對靶向基因進行特定DNA修飾的技術。在該技術中，crRNA(CRISPR-derived?RNA)通過堿基配對與tracrRNA(trans-activating?RNA)結合形成雙鏈RNA，得到tracrRNA/crRNA二元復合體。所得到的tracrRNA/crRNA二元復合體能夠指導Cas9蛋白在與crRNA引導序列匹配的靶定位點剪切雙鏈DNA，從而達到對基因組DNA進行修飾的目的。CRISPR/Cas9系統能夠對多種物種的基因組特定基因位點進行精確編輯，目前已經成功應用于大、小鼠、人源細胞等基因敲除和敲入的模型制備。

Cas9系統進行有效工作需要三種元件，即crRNA(CRISPR-derived?RNA，靶標識別20個或30個堿基)、tracrRNA(trans-activating?RNA)及Cas9蛋白。

由于crRNA和tracrRNA可以串聯操作，所以三元件系統也可以簡化成兩元件系統，即chiRNA(由crRNA及tracrRNA串聯簡并而成，靶標識別20個堿基)、Cas9蛋白。故而目前利用Cas9系統進行基因組編輯及基因表達調控的主流策略共有兩種：三元件系統、二元件系統。

然而，目前利用Cas9系統進行基因組編輯及基因表達調控的方法仍有待改進。

發明內容

需要說明的是，本發明是基于發明人的下列發現而完成的：

現階段，利用Cas9系統進行基因組編輯及基因表達調控，主要有兩種策略：一是外源質粒系統策略；二是體外轉錄合成chiRNA策略。

其中，第一種策略(即外源質粒系統策略)，是將Cas9系統相關的元件組裝在外源表達質粒系統中，即為將三元件系統或兩元件系統中的元件全部整合在一個外源表達載體上，針對基因組中不同的靶點，每次只需對相應的crRNA或chiRNA部分進行質粒的重組即可，其他部分不用操作，然后將質粒轉入相應的實驗模型中就可以使其工作。該策略具有以下缺點：

1.靶點選擇的局限：目前常用的靶向識別位點長度為20個堿基，由于U6啟動子后連接的第一個堿基必須為G(鳥嘌呤)，因此限定了該20個堿基的第一個堿基必須為G，這就造成了很強的限制，致使靶點的選擇喪失了極大的選擇空間；

2.單質粒系統：構建好的外源質粒過大，會產生不易轉染(尤其對于轉染效率本來就很低的細胞尤甚)或轉染拷貝數過低的問題，而這是Cas9系統常見的效率低下的主因；

3.多質粒系統：如需使Cas9系統起效，就要要求全部元件共轉入同一細胞，而共轉效率卻是此技術策略的瓶頸；

4.病毒載體系統：Cas9蛋白過大，為4千多個bp，不易包裝，致使病毒的包裝成功率過低，難以高效的行使功能；

5.針對不同位點：需要多次構建crRNA或chiRNA的載體表達部分，操作不便；

6.一次性針對多位點操作：需要多個質粒共同轉染，共轉效率低，致使針對多靶點的操作效率低下；

7.Cas9蛋白表達量不穩定：外源表達的Cas9基因轉入每個細胞的拷貝數不同，造成細胞中Cas9蛋白的表達量不穩定、均一，限制了Cas9系統的工作效率；

8.針對高、中通量操作，周期長，時間成本、人力成本過高。

第二種策略(即體外轉錄合成chiRNA策略)，是將現有的Cas9二元件系統分離，即分為：體外轉錄chiRNA和cas9蛋白。體外轉錄chiRNA是通過質粒構建的方式將靶點序列插入到譬如pT7-gRNA這樣的載體上，再用T7或SP6等轉錄酶在實驗室體外環境下制備成chiRNA；Cas9蛋白的表達在這一方案中有多種形式：通過轉染實現的外源表達，Cas9mRNA(亦為體外轉錄)的胚胎注射，通過病毒載體整合到基因組中，將Cas9基因序列定點敲入到基因組中。該策略具有以下缺點：