[發明專利]一種可用于微衛星檢測的多重熒光PCR通用接頭及檢測方法和應用

有效

• 申請號: 201410345866.6
• 申請日: 2014-07-18
• 公開（公告）號: CN104178566A
• 公開（公告）日: 2014-12-03
• 發明（設計）人: 趙建;朱新平;李偉;王亞坤;文萍
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國華

技術領域

本發明屬于多重熒光PCR技術領域，具體涉及一種可用于微衛星檢測的多重熒光PCR通用接頭及利用其進行微衛星多重PCR檢測的方法和應用。?

背景技術

微衛星(Microsatellite)又稱簡單序列重復(Simple?Sequence?Repeat，SSR)、短串聯重復(Short?tandem?repeats)、簡單序列長度多態性(Simple?sequence?length?polymorphism)，它是DNA分子中的一個片段，以1-6bp的核苷酸序列(稱為核心序列，coresequence)成首尾相連串聯重復均勻地分布在整個基因組中的高度重復序列。一般長幾十至幾百bp。它們廣泛分布在各種真核生物基因組中，且分布比較均勻。微衛星的等位基因具有突變快、多態性高、雜合度大、信息含量豐富、呈共顯性等和在實驗操作中材料易得且樣品需要量少、操作程序簡單且難度系數小、可用PCR擴增檢測位點且等位基因條帶易于識別等特點。微衛星標記多用來分析生物遺傳多樣性、群體的遺傳結構及種群的親緣關系、遺傳圖譜的建立和基因定位、種質資源的保護和微衛星DNA指紋庫的建立等。微衛星位點的PCR擴增主要采用單對引物擴增和多重PCR擴增方式，根據檢測技術的不同其引物采用普通引物或熒光標記引物。?

單對引物擴增使用普通引物，每個PCR反應體系中僅擴增一個位點，然后使用凝膠電泳的方法分離，確定擴增的等位基因，操作方法和儀器設備比較簡單，但效率較低。?

多重PCR(multiplex?PCR)可以將多對經過熒光標記的引物在同一反應體系中同時擴增，可以將2對以上至20對微衛星引物進行同時擴增，通過目的片段大小范圍的不同和標記熒光不同區分不同位點的擴增產物。進行微衛星多重PCR的分型多利用ABI公司的遺傳分析儀進行，可以進行4(FAM、JOE，NED和ROX)色或5色(FAM、VIC、PET，NED和LIZ)熒光分型(除分子量marker內標使用1色熒光，實際使用3色或4色熒光)，即除利用片段大小范圍的不同進行區分外，還可以將片段大小重疊的3對或4對引物通過標記不同顏色的熒光進行區分。這樣可以增加多重PCR的引物數。多重PCR需要預先對待擴增的微衛星引物進行擴增效率、組合的匹配程度進行試驗，一旦確定引物組合，就可以極大的提高后續實驗效率。多重PCR技術是將來微衛星標?記分型的主流技術手段，將極大的促進微衛星標記的應用。?

目前進行多重PCR都是對所有正向引物的5’端進行熒光標記。例如，對于一組同時進行10個位點擴增的多重PCR體系，需要將10對引物的正向引物分別進行熒光標記，這就需要合成10條熒光標記引物。熒光引物的合成費用比普通引物高的多，根據標記熒光不同，每條引物普遍需要300～500元/2OD，而且合成的周期也比普通引物長的多。實驗過程中若合成的引物不能加入多重PCR體系，則合成的熒光引物就不能用于后續實驗。確定一組多重PCR引物，一般合成的熒光標記引物只有一部分能夠用于實驗，造成經費和時間的浪費。?

發明內容

本發明的第一個目的在于提供一種可用于微衛星檢測的多重熒光PCR通用接頭，該通用接頭PCR擴增效率高，不互相干擾，也不會對待擴增微衛星引物產生干擾。?

本發明的第二個目的在于提供一種利用上述可用于微衛星檢測的多重熒光PCR通用接頭進行微衛星多重PCR檢測的方法，該方法進行多重PCR時只需合成4條或3條熒光接頭即可進行引物篩選和分型實驗，步驟簡潔，實驗時間短，實驗成本低。?

本發明的最后一個目的在于提供上述可用于微衛星檢測的多重熒光PCR通用接頭在微衛星位點檢測方面的應用。?

本發明的第一個目的是通過以下技術方案來實現的：一種多重熒光PCR通用接頭，包括4條接頭，分別為接頭1、接頭2、接頭3和接頭4，接頭1～4的核苷酸序列如SEQID：1～4中所示。?

其中接頭1-4的核苷酸序列如下：?

接頭1：CACGACGTTGTAAAACGAC?

接頭2：CAGGAACTCAGTGTGACACTC?

接頭3：CGACAGACAGTAAGGTCTCTG?

接頭4：AGCTCGACCAGTGAGTCAG。?

本發明用到的4種熒光標記接頭由ABI公司合成，也可用其他同色熒光替代，這4個接頭是根據細菌的質粒序列設計的，目的是與真核生物的序列同源性最低，避免非特異性擴增干擾，其可以應用在微衛星的多重PCR檢測中，也可應用于其他多重PCR中。?