[發明專利]一種檢測腸癌熱點基因突變位點的組合物及其使用方法

有效

• 申請號: 201410345693.8
• 申請日: 2014-07-18
• 公開（公告）號: CN104099422A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發明（設計）人: 王弢;李宗飛;張利清;張麗;樂飚;徐維琛
• 申請（專利權）人: 普世華康江蘇醫療技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 蘇州華博知識產權代理有限公司 32232
• 代理人: 何蔚

技術領域

本發明涉及基因檢測領域，特別是涉及檢測腸癌驅動基因熱點突變的組合物。

背景技術

腸癌是結直腸癌和直腸癌的總稱，大腸癌的發病率從高到低依次為直腸、乙狀結腸、盲腸、升結腸、降結腸及橫結腸，近年有向近端(右半結腸)發展的趨勢。腸癌的發病與生活方式、遺傳、大腸腺瘤等關系密切。

研究發現，腸癌的發生與KRAS、BRAF、PIK3CA熱點基因的突變有很大的關系。K-ras基因位于12號染色體短臂上，35kb，屬于Ras基因家族的一員。在Ras基因中，K-Ras對人類癌癥影響最大，它好像分子開關：正常時能控制調控細胞生長的路徑；發生異常時，則導致細胞持續生長，并阻止細胞自我毀滅。它參與細胞內的信號傳遞，當K-ras基因突變時，該基因永久活化，不能產生正常的ras蛋白，使細胞內信號傳導紊亂，細胞增殖失控而癌變。K-ras基因檢測是目前醫生了解大腸癌患者癌基因狀況最直接、最有效的方法。看K-ras基因有沒有突變，可以篩選出抗EGFR(表皮生長因子受體)靶向藥物治療有效的大腸癌患者，實現腫瘤病人的個體化治療，從而延長患者生存期。BRAF基因基因編碼一種絲/蘇氨酸特異性激酶，參與調控細胞內多種生物學事件，如細胞生長、分化和凋亡等。在結直腸癌患者中，BRAF基因突變率為15％，美國國家癌癥綜合治療聯盟《結直腸癌臨床實踐指南》(V3.2011)建議，在使用愛必妥或帕尼單抗等靶向藥物時，須檢測腫瘤組織KRAS基因狀態，如果KRAS無突變，應考慮檢測BRAF基因狀態。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)是EGFR下游信號分子，可被生長因子受體酪氨酸激酶(如EGFR)激活，使絲/蘇氨酸激酶(AKT)磷酸化產生多種生物學效應，包括調節細胞增殖、存活和細胞周期調控等。研究發現PIK3CA基因產生突變與結腸癌等多種癌癥發病存在相關性，32％的結腸癌患者體內基因PIK3CA存在突變而在成膠質細胞瘤、胃癌、乳腺癌和肺癌患者中，該基因存在突變的比例分別為27％、25％、8％和4％。NRAS基因是RAS基因家族中的一員，參與細胞內的信號傳遞。目前，應用于腸癌靶向治療的藥物主要有愛必妥(默克公司)和帕尼單抗(安進公司)，然而靶向藥物在不同患者中有不同的療效，有效率約為20～50％。通過對腸癌患者進行靶基因突變檢測，能夠科學的判斷該病人能否適應靶向藥物治療，指導病人用藥，實現病人的個體化醫療。

目前檢測基因突變的方法主要有以下幾種：

(1)直接測序法。直接測序法是運用探針進行PCR擴增并對擴增產物進行測序和TA克隆并再次測序以最終確定突變的堿基位置。該方法比較繁瑣、耗時長，而且由于自身的限制導致其靈敏度不高，只能對含量大于20％的基因突變進行檢測。因此，此法不適合在臨床中的應用與大量的臨床樣本分析。

(2)變性高效液相色譜法(DHPLC)。該方法的原理是基于發生錯配的雜合雙鏈DNA與完全匹配的純合雙鏈DNA解鏈特征的差異將他們分離開。通過洗脫峰的不同判斷有無突變存在。DHPLC可檢測出含有單個檢測的突變、插入或者缺失的異源雙鏈片段。該法對已知和未知的突變位點均可以檢測，敏感性在5％左右，但檢測過程中需要打開反應管，容易造成污染，而且陽性結果不能確認其具體未知，最終還需測序確認。

(3)高分辨率熔解曲線(HRM)。高分辨率熔解曲線是基于核酸的物理性質，通過飽和染料結合于PCR擴增產物，監控產物熔解曲線的變化分析基因突變。檢測敏感性在5％左右，對于陽性結果并不能確定其具體位置，最終還需要通過測序加以確認。

(4)探針擴增阻滯突變法(ARMS)。利用PCR引物的3’端末位堿基必須與其模板DNA互補才能有效擴增的原理，設計針對突變位點的特異性PCR擴增引物，在嚴格的條件下，只有在引物3’堿基與模板配對時PCR擴增反應才能正常進行，從而檢測出突變。通過設計兩個5’端引物，一個與正常DNA互補，一個與突變DNA互補，對于純和性突變，分別加入兩種引物及3’端引物進行兩個平行的PCR，結合有與突變DNA完全互補的引物才可以延伸并得到PCR擴增產物，該檢測方法的靈敏度在1％左右。

(5)等位基因特異的Taqman聚合酶鏈式反應(CAST-PCR)。CAST-PCR法采用優化TaqMan探針，通過一段特異設計的MGB探針來阻止引物與野生型DNA結合，選擇性的優先擴增突變型DNA，該檢測方法的靈敏度在0.1～1％左右。

但這些技術的靈敏度都不高，檢測的特異性差，誤診率高，不能滿足對腸癌檢測的需求。

發明內容