[發明專利]一種檢測腸癌熱點基因突變位點的組合物及其使用方法

有效

• 申請號: 201410345693.8
• 申請日: 2014-07-18
• 公開（公告）號: CN104099422A
• 公開（公告）日: 2014-10-15
• 發明（設計）人: 王弢;李宗飛;張利清;張麗;樂飚;徐維琛
• 申請（專利權）人: 普世華康江蘇醫療技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 蘇州華博知識產權代理有限公司 32232
• 代理人: 何蔚

1.一種檢測腸癌熱點基因突變位點的組合物，其特征在于，所述組合物包括SEQ?NO：1至SEQ?NO：17的引物序列，還包括SEQ?NO：18至SEQ?NO：21的block序列。

2.如權利要求1所述的檢測腸癌熱點基因突變位點的組合物，其特征在于，所述組合物在用于PCR擴增時的反應體系為：1～10×PCR緩沖液、0.1～1mM?dNTPs、0.1～1uM正向引物、0.1～1μM反向引物、0.1～2μM?block、0.05～2ng/μL模版DNA、Eva?Green染料0.5～2μL、0.01～0.10U/μl?TaqDNA聚合酶、1～5mM氯化鎂。

3.如權利要求1或2所述的檢測腸癌熱點基因突變位點的組合物，其特征在于，所述block序列為PCR擴增反應中所用，是一段與野生型DNA序列完全匹配的可偏向性擴增突變DNA序列的突變型特異性引物。

4.如權利要求1～3所述的檢測腸癌熱點基因突變位點的組合物的使用方法，其特征在于，所述使用方法的步驟為：

第一步：將待測樣品、陰性質控品、陽性質控品和無模版對照進行PCR擴增反應，其中，所述PCR擴增反應以待測DNA為模板，設計針對目的基因突變位點的特異性引物，同時加入LNA鎖核酸修飾，通過對待測DNA樣品中的目的基因進行偏向性PCR擴增反應；

第二步：根據儀器檢測結果中Ct值和MeltCure的判讀，判斷所述待測樣品中目的基因的突變情況。

5.根據權利要求4所述的檢測腸癌熱點基因突變位點的組合物的使用方法，其特征在于，通過PCR擴增反應結果中擴增曲線和熔解曲線主峰來鑒別DNA特定突變。

6.根據權利要求4所述的檢測腸癌熱點基因突變位點的組合物的使用方法，其特征在于，所述根據Ct值和MeltCure的判讀來判斷待測樣品中目的基因的突變情況，其具體步驟為：

1).運行CT值的計算，無模板對照應無特異擴增，或僅引物二聚體導致的熒光信號增強；當Ct值≥45.0時，表明無模板對照有微弱的擴增，對試驗的影響極微，可以繼續分析試驗情況；

2).運行內控，一般Ct值＜40.0，可以繼續分析，如果Ct值≥40.0，則說明樣品DNA降解嚴重，不適合試驗需要；

3).運行陽性質控品，陽性質控的Ct值＜45.0，熔解曲線最高峰的Tm值在相應突變的范圍內，說明試驗體系正常，可以繼續分析試驗結果；

4).符合上述條件，運行Tm?calling程序，通過熔解曲線分析和Ct值，判讀樣本是否存在突變：運行Tm?calling程序，若樣本熔解曲線最高峰的Tm值在相應突變的范圍內，并且Ct＜45，表明擴增區段發生突變；若樣本存在以下三種情況之一，則判斷為陰性：a，無擴增；b，有擴增，Ct≥45；c，有擴增，Ct＜45，但是運行Tm?calling程序，熔解曲線最高峰的Tm值不在相應突變的范圍內；

5).如果不符合上述第1、3項要求，建議重做本次實驗；如果不符合第2項要求，建議重新從樣本中提取DNA，再次檢測。

7.根據權利要求4所述的檢測腸癌熱點基因突變位點的組合物的使用方法，其特征在于，所述待測樣品為人類基因組DNA，所述陽性質控品為含有KRAS、BRAF、PIK3CA基因突變的混合質粒或者純合質粒，所述陰性質控品為不含有KRAS、BRAF、PIK3CA基因突變的混合質粒或者純合質粒。

8.根據權利要求4所述的檢測腸癌熱點基因突變位點的組合物的使用方法，其特征在于，所述待測DNA為人類正常DNA、細胞DNA、腫瘤組織基因組DNA、外周血細胞DNA、外周血血清或血漿DNA、體液DNA或排泄物細胞DNA。

9.根據權利要求4所述的檢測腸癌熱點基因突變位點的組合物的使用方法，其特征在于，所述腸癌熱點基因為KRAS、BRAF、PIK3CA基因野生型和KRAS、BRAF、PIK3CA基因突變型。

10.根據權利要求9所述的檢測腸癌熱點基因突變位點的組合物的使用方法，其特征在于，所述KRAS、BRAF、PIK3CA基因包含G12R、G12S、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D、E542K、E545K、E545D、H1047L、H1047R、H1047、V600E。