[發(fā)明專利]一種夾心型肺癌腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410344987.9
• 申請日: 2014-07-21
• 公開（公告）號: CN104155447A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張勇;魏琴;吳丹;馬洪敏;龐雪輝
• 申請（專利權(quán)）人: 濟(jì)南大學(xué)
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N27/26
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種夾心型肺癌腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備和應(yīng)用。具體是采用新型納米功能材料作為模擬酶標(biāo)記二抗，實(shí)現(xiàn)對肺癌腫瘤標(biāo)志物的快速、靈敏檢測，屬于新型納米功能材料與生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

肺癌是對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率增長最快。據(jù)報(bào)道，近五十年來肺癌的發(fā)病率明顯增高，在男性惡性腫瘤患者中，肺癌發(fā)病率和死亡率均占第一位，在女性惡性腫瘤患者中，發(fā)病率和死亡率均占第二位。因此，肺癌的早期診斷、早期治療是提高肺癌患者生存率的關(guān)鍵。肺癌腫瘤標(biāo)志物的檢測可反映肺癌的生物學(xué)特性，對治療、輔助診斷、判斷預(yù)后均有重要意義。目前已有的肺癌腫瘤標(biāo)志物的臨床檢測方法很多，如酶免疫法、放射免疫法等，但這些檢測方法存在諸多不足，如酶免疫法中酶容易失活、放射免疫法中放射性污染嚴(yán)重等。因此，發(fā)明一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、工作條件要求不高的環(huán)境友好型肺癌腫瘤標(biāo)志物傳感器迫在眉睫。

免疫傳感器是源于抗原抗體特異性結(jié)合的鑒別功能而研制成的一類生物傳感器，并且電化學(xué)免疫傳感器是免疫傳感器中種類最多的、而且是研究最早的，同時(shí)也是比較成熟的一個(gè)分支。由于它擁有靈敏度高、分析速度快、體積小、選擇性好、適合聯(lián)機(jī)化等優(yōu)點(diǎn)，所以在環(huán)境保護(hù)、臨床診斷、藥物分析和食品安全檢測中有著很好的應(yīng)用前景。貴金屬核殼納米材料具有單一材料不具備的優(yōu)良性能，受到人們的廣泛關(guān)注。將貴金屬核殼納米材料用于電化學(xué)傳感器的構(gòu)建，可以大大提高免疫傳感器的靈敏度和重現(xiàn)性等。

本發(fā)明創(chuàng)造性的使用金@銀核殼納米棒納米材料作為模擬酶，與二抗孵化后作為標(biāo)記物，制備了用于肺癌腫瘤標(biāo)志物檢測的夾心型電化學(xué)免疫傳感器。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一在于避免現(xiàn)有檢測方法中存在的儀器設(shè)備復(fù)雜、操作過程繁瑣及對檢驗(yàn)人員的技能要求高等缺點(diǎn)，提供一種夾心型電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，所制備的傳感器具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，且制備簡單、操作方便，可用于肺癌腫瘤標(biāo)志物的快速、靈敏檢測；

本發(fā)明的目的之二在于將所制備的夾心型肺癌腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器，使用新型功能材料作為模擬酶，替代了生物酶，避免了實(shí)際樣品檢測時(shí)生物酶失活及檢測環(huán)境的影響。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

1.?本發(fā)明所述的一種夾心型肺癌腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器的制備方法，所述夾心型肺癌腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器包括：工作電極、參比電極和對電極，所述工作電極的基底電極為玻碳電極，其表面依次修飾還原石墨烯（rGO）、金納米棒溶膠（Au?NRs）、殼聚糖溶液（Chs）、肺癌腫瘤標(biāo)志物一抗（Ab₁）、牛血清蛋白（BSA）、肺癌腫瘤標(biāo)志物抗原和金@銀核殼納米棒溶膠孵化的肺癌腫瘤標(biāo)志物二抗（Au@AgNRs-Ab₂），所述參比電極為飽和甘汞電極，所述對電極為鉑絲電極，所述Au?NRs為20~40nm長的棒狀金納米粒子的水溶液；

其特征在于，所述制備方法包括以下制備步驟：

（1）Au@AgNRs-Ab₂的制備

將20mLAu?NRs和20mL?0.05~0.2?mol/L的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）溶液混合，在30~45℃下攪拌，并順序加入3~6?mL?0.1?mol/L的?L-抗壞血酸（AA）溶液、0.5~1?mL?0.05?mol/L的硝酸銀（AgNO₃）溶液和?3~6?mL?0.1?mol/L的氫氧化鈉（NaOH）溶液，停止攪拌，靜置1~3h，離心分離，加入20mL?pH7.4的PBS緩沖溶液中，然后再加入肺癌腫瘤標(biāo)志物二抗（Ab₂），在4℃下震蕩24h，得到Au@AgNRs-Ab₂。

（2）夾心型肺癌腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器工作電極的制備方法

1）對工作電極進(jìn)行預(yù)處理，使其表面光潔；

2）在1）中得到的電極表面滴加5~10?μL?1~5?mg/mL的rGO水溶液，室溫下自然晾干；

3）在2）中得到的電極表面滴加5~10?μL的Au?NRs，室溫下自然晾干；

4）在3）中得到的電極表面滴加3~6?μL?質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%?的殼聚糖溶液（CHs）；

5）在4）中得到的電極表面滴加5~8?μL?10?μg/mL的Ab₁溶液，4?℃?冰箱中保存晾干，超純水清洗，晾干成膜，4?℃保存；