[發明專利]一種夾心型肺癌腫瘤標志物免疫傳感器的制備和應用

有效

• 申請號: 201410344987.9
• 申請日: 2014-07-21
• 公開（公告）號: CN104155447A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 張勇;魏琴;吳丹;馬洪敏;龐雪輝
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N27/26
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

1.一種夾心型肺癌腫瘤標志物免疫傳感器的制備方法，所述夾心型肺癌腫瘤標志物免疫傳感器包括：工作電極、參比電極和對電極，所述工作電極的基底電極為玻碳電極，其表面依次修飾還原石墨烯（rGO）、金納米棒溶膠（Au?NRs）、殼聚糖溶液（Chs）、肺癌腫瘤標志物一抗（Ab₁）、牛血清蛋白（BSA）、肺癌腫瘤標志物抗原和金@銀核殼納米棒溶膠孵化的肺癌腫瘤標志物二抗（Au@AgNRs-Ab₂），所述參比電極為飽和甘汞電極，所述對電極為鉑絲電極，所述Au?NRs為20~40nm長的棒狀金納米粒子的水溶液；

其特征在于，所述制備方法包括以下步驟：

a、制備Au@AgNRs-Ab₂；

b、制備夾心型肺癌腫瘤標志物免疫傳感器工作電極；

其中，步驟a制備Au@AgNRs-Ab₂的具體步驟如下：

將20mLAu?NRs和20mL?0.05~0.2?mol/L的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）溶液混合，在30~45℃下攪拌，并順序加入3~6?mL?0.1?mol/L的?L-抗壞血酸（AA）溶液、0.5~1?mL?0.05?mol/L的硝酸銀（AgNO₃）溶液和?3~6?mL?0.1?mol/L的氫氧化鈉（NaOH）溶液，停止攪拌，靜置1~3h，離心分離，加入20mL?pH7.4的PBS緩沖溶液中，然后再加入肺癌腫瘤標志物二抗（Ab₂），在4℃下震蕩24h，得到Au@AgNRs-Ab₂；

步驟b制備夾心型肺癌腫瘤標志物免疫傳感器工作電極的具體步驟如下：

1）對工作電極進行預處理，使其表面光潔；

2）在1）中得到的電極表面滴加5~10?μL?1~5?mg/mL的rGO水溶液，室溫下自然晾干；

3）在2）中得到的電極表面滴加5~10?μL的Au?NRs，室溫下自然晾干；

4）在3）中得到的電極表面滴加3~6?μL?質量分數為0.5%?的殼聚糖溶液（CHs）；

5）在4）中得到的電極表面滴加5~8?μL?10?μg/mL的Ab₁溶液，4?℃?冰箱中保存晾干，超純水清洗，晾干成膜，4?℃保存；

6）在5）中得到的電極表面滴加3~6?μL?1%的BSA溶液，用以封閉電極上的非特異性活性位點，4?℃?冰箱中保存晾干，超純水清洗，晾干成膜，滴上一系列濃度不同的肺癌腫瘤標志物抗原溶液；

7）在6）中得到的電極表面滴加4~6?μL?預先孵化好的Au@AgNRs-Ab₂溶液，?4?℃?冰箱中保存晾干，超純水清洗，晾干成膜，即得到夾心型肺癌腫瘤標志物免疫傳感器的工作電極；

所述的Chs是將殼聚糖純品加入到體積分數為1%?的醋酸中制備而成。

2.如權利要求1所述的夾心型肺癌腫瘤標志物免疫傳感器，用于肺癌腫瘤標志物的檢測，步驟如下：

1）將已知濃度的肺癌腫瘤標志物抗原標準溶液加入到40~60?μL、pH=7.0~8.0的PBS緩沖溶液中，制得抗原混合溶液，取5~10?μL抗原混合溶液滴涂到所制備的夾心型肺癌腫瘤標志物免疫傳感器的工作電極上，在4?℃?冰箱中保存晾干，pH=7.0~8.0的PBS緩沖溶液清洗后，晾干，4?℃保存；

2）將作為參比電極的甘汞電極、作為對電極的鉑絲電極，與1）中組裝的工作電極組成三電極系統，連接到電化學工作站上；在電解槽中先后加入10~25mL?pH=7.0~8.0的PBS緩沖溶液和20uL?3~6?mol/L的過氧化氫（H₂O₂）溶液；通過計時電流法檢測組裝的工作電極對H₂O₂的響應；根據所得的電流響應與腫瘤標志物抗原標準溶液濃度之間的關系，繪制工作曲線；

3）將待測樣品溶液代替肺癌腫瘤標志物抗原的標準溶液，按照所述肺癌腫瘤標志物抗原的工作曲線的繪制方法進行檢測。

3.如權利要求1和2所述的夾心型肺癌腫瘤標志物免疫傳感器的制備方法和應用，其特征在于所述肺癌腫瘤標志物選自下列之一：癌胚抗原（CEA）、糖類抗原（CA-125）、糖類抗原（CA-242）、神經元特異性烯醇化酶（NSE）、組織多肽抗原（TPA）、鱗狀細胞癌抗原（SCC）。