[發明專利]一種人臍帶華通氏膠組織的凍存保護液及其制備與應用

有效

• 申請號: 201410344918.8
• 申請日: 2014-07-21
• 公開（公告）號: CN104145943A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 陳林;董偉;張坤
• 申請（專利權）人: 重慶市紅匯臍血干細胞中心有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 重慶中流知識產權代理事務所(普通合伙) 50214
• 代理人: 陳立榮

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種人臍帶華通氏膠組織的凍存保護液及其制備與應用。?

背景技術

臍帶間充質干細胞是來源于發育早期的中胚層和外胚層，具有自我更新、造血支持、免疫調控和多向分化潛能，目前臨床上可用于糖尿病終末期并發癥，紅斑狼瘡，組織器官損傷修復及造血干細胞輔助治療等諸多方面。?

目前，臨床應用的干細胞種類繁多，與它們相比，臍帶間充質干細胞具有免疫原性低，移植不會出現免疫排斥等副作用，采集過程簡單的優點，同時臍帶間充質干細胞還具有很強的增殖和分化能力，極少出現病毒和微生物感染，對產婦和新生兒無損害，因此，臍帶間充質干細胞是目前理想的干細胞來源。?

華通氏膠是構成臍帶的凝膠狀物質，其含有黏多糖、成纖維細胞和巨噬細胞，是一種粘膜組織，膠內部分細胞具有干細胞的特質，因此可以從臍帶的華通氏膠中分離出臍帶間充質干細胞，是目前比較理想的干細胞來源。隨之而來的對臍帶華通氏膠組織進行凍存成為了現今的研究熱點，現有技術中主要采用傳統的細胞冷凍方法對人臍帶華通氏膠組織進行凍存。如申請號為201210159916.2名稱為《臍帶組織凍存、復蘇以及分離和擴增干細胞的方法》公開了臍帶組織的凍存方法，主要步驟是對臍帶組織進行消毒和清洗，將組織剪成塊狀；然后將組織塊和凍存液加入凍存管中，在4℃的溫度條件下低溫冷藏0.5h，再在-80℃的溫度條件下冷凍1天，然后再液氮中冷凍備用即可，雖然其達到了凍存人臍帶組織的目的，但是這樣的臨床凍存方法需要花費較多的時間和成本，而還存在有如下缺點：?1、降溫過程中，冷凍保護液在固液相變點處釋放的熱量無法及時抵消，導致臍帶組織溫度反而上升，影響冷凍效果；2、無法準確知道冷凍過程中樣品溫度變化情況，不利于質量控制；3、所用培養基中含有動物血清成分，異種血清的使用存在著很多不確定因素，比如，血清批次之間的差別，異種蛋白的免疫原性，潛在的病原體等，可能對將來臨床應用構成威脅。?

發明內容

針對現有技術存在的上述技術問題，本發明的目的是提供一種對細胞損傷小，毒副作用低，凍存效果好的人臍帶凍存保護液，并提供一種易于制備，保存簡單的人臍帶凍存保護液的制備方法。?

本發明的另一目的是提供一種采用上述人臍帶凍存保護液的應用，也就是采用上述人臍帶凍存保護液對人臍帶華通氏膠組織進行凍存方法。?

為了解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：?

一種人臍帶華通氏膠組織的凍存保存液，包括如下體積百分比的組分：

滲透性冷凍保護劑5~10%、非滲透性冷凍保護劑1~5%、血清替代品10~20%和無血清基礎培養基70~80%。

本方案中，滲透性冷凍保護劑是可以透過細胞膜滲透到細胞內的小分子物質，用于人臍帶華通氏膠的凍存時，在人臍帶華通氏膠冷凍懸液完全凝固之前，可以滲透到細胞內，降低細胞內外未結冰溶液中電解質的濃度，使人臍帶華通氏膠組織不會被高濃度電解質損傷，組織內水分不會過分外滲，避免組織過分脫水而傷害細胞。非滲透性冷凍保護劑一般是些大分子物質，不能滲透到細胞內，通過優先同溶液中的水分子相結合，降低溶液中自由水的含量，使冰點降低，減少冰晶的形成；同時，由于其分子量大，使溶液中電解質濃度降低，從而減輕溶質損傷。血清替代品為人工合成，組分明確，安全，批次間差異小，能夠替代血清提供細胞生長所需的營養、激素和生長因子，同時在凍存過程中對細胞提供一定程度的保護。無血清基礎培養基是指用人工方法配制而成的，未添加血清，含各種氨基酸和葡萄糖等細胞生長基本營養物質的營養液。?

本方案中，滲透性冷凍保護劑通過與非滲透性冷凍保護劑、血清替代品和無血清基礎培養基協同增效作用，在凍存過程中對細胞損傷小，毒副作用低，其凍存效果好。?

作為優化，所述人臍帶華通氏膠組織的凍存保護液包括如下體積百分比的組分：滲透性冷凍保護劑10%、非滲透性冷凍保護劑5%、血清替代品10%和無血清基礎培養基75%。?

本方案中，采用滲透性冷凍保護劑10%、非滲透性冷凍保護劑5%、血清替代品10%和無血清基礎培養基75%制備人臍帶華通氏膠組織的凍存保護劑，在保證凍存保護液性能最好的同時，避免了異種血清的使用（例如常用的胎牛血清），消除了將來臨床使用障礙，同時與其他的無血清配方凍存保護液相比（如201210159916.2《臍帶組織凍存、復蘇以及分離和擴增干細胞的方法》），使用大量無血清基礎培養基替代人血白蛋白，有效節約了成本。?

作為優化，所述滲透性冷凍保護劑為二甲基亞楓或者甘油。?