[發明專利]一種人臍帶華通氏膠組織的凍存保護液及其制備與應用

有效

• 申請號: 201410344918.8
• 申請日: 2014-07-21
• 公開（公告）號: CN104145943A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 陳林;董偉;張坤
• 申請（專利權）人: 重慶市紅匯臍血干細胞中心有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 重慶中流知識產權代理事務所(普通合伙) 50214
• 代理人: 陳立榮

1.一種人臍帶華通氏膠組織的凍存保存液，其特征在于，包括如下體積百分比的組分：滲透性冷凍保護劑5~10%、非滲透性冷凍保護劑1~5%、血清替代品10~20%和無血清基礎培養基70~80%。

2.根據權利要求1所述的人臍帶華通氏膠組織的冷凍保存液，其特征在于，包括如下體積百分比的組分：滲透性冷凍保護劑10%、非滲透性冷凍保護劑5%、血清替代品10%和無血清基礎培養基75%。

3.根據權利要求1或者2所述的人臍帶華通氏膠組織的冷凍保存液，其特征在于，所述滲透性冷凍保護劑為二甲基亞砜或者甘油。

4.根據權利要求3所述的人臍帶華通氏膠組織的冷凍保存液，其特征在于，所述非滲透性冷凍保護劑為羥乙基淀粉或者人血白蛋白。

5.根據權利要求4所述的人臍帶華通氏膠組織的冷凍保存液，其特征在于，所述血清替代品為FetalClone?III或者Ultroser?G。

6.根據權利要求5所述的人臍帶華通氏膠組織的冷凍保存液，其特征在于，所述無血清基礎培養基為DMEM/F12或者RPMI1640。

7.根據權利要求6所述的人臍帶華通氏膠組織的凍存保護液，其特征在于，包括如下體積百分比的組分：二甲基亞砜10%，人血白蛋白5%，FetalClone?III?10%和DMEM/F12?75%。

8.一種權利要求1~7任一項所述的人臍帶華通氏膠組織的凍存保護液的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

　　　1）將無血清基礎培養基、非滲透性冷凍保護劑和血清替代品置于2-6℃下預冷，然后將其混合、搖勻；

　　　2）向步驟1）得到的混合物中加入滲透性冷凍保護劑，搖勻；

　　　3）將步驟2）所得混合物置于2~6℃溫度條件下冷藏30min以上，即得人臍帶華通氏膠組織凍存保護液。

9.一種人臍帶華通氏膠組織的凍存方法，其特征在于，包括如下步驟：

　　　1）臍帶預處理：在二級生物安全柜中，用醫用酒精對臍帶組織表面消毒，然后剪去臍帶結扎兩端，并用無菌PBS清洗3~5次，以去除臍帶表面和血管內的血液及凝塊；

　　　2）剝取華通氏膠組織：將步驟1）處理后的臍帶剪為1~3cm長的小段，再用無菌PBS溶液洗去殘余血液與凝塊，再剝離臍動脈組織和臍靜脈組織；然后剝取華通氏膠組織，在將得到的華通氏膠組織剪為1~2mm²的小塊；

　　　3）人臍帶華通氏膠組織凍存：取權利要求1~7任一項所述人臍帶華通氏膠組織凍存保護液，備用；然后將步驟2）得到的華通氏膠組織重懸于所述人臍帶華通氏膠組織凍存保護液中，再將其置于2~6℃下預冷20~30min，然后進行程序降溫處理即可；

　　　所述程序降溫處理的具體操作為：首先，置于4℃下冷藏10min；然后以1~1.5℃/min的速率降溫至-40℃，再以10℃/min的速率降溫至-90℃，?最后迅速轉移至液氮-190℃環境儲藏即可。

10.根據權利要求9所述的人臍帶華通氏膠組織的凍存方法，其特征在于，步驟3）中人臍帶華通氏膠組織的凍存保護液的體積和人臍帶華通氏膠組織的質量的比例為2ml:1g.。