[發明專利]一種核酸顯色劑及其應用

有效

• 申請號: 201410341974.6
• 申請日: 2014-07-17
• 公開（公告）號: CN104099419B
• 公開（公告）日: 2017-09-08
• 發明（設計）人: 黃昱陽;熊槐;杜正平;曹以誠
• 申請（專利權）人: 廣州華峰生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12M1/24
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司44202
• 代理人: 郝傳鑫,付靜

技術領域

本發明屬于核酸顯色劑領域，尤其涉及一種在室溫下可長期保存且可肉眼直接判讀核酸擴增反應產物的陰性或陽性的核酸顯色劑及其應用。

背景技術

花青類染料，如SYBR Green I、SYBR Green II、SYBR Gold、GelStar等可用于DNA、RNA的分析和檢測。這類花青類染料單獨存在時只能發出微弱的熒光，一旦結合到單鏈或雙鏈核酸上以后，能夠激發出千倍以上的熒光增量。例如，高濃度的SYBR Green I溶液呈現出橙黃色或是橘紅色，與核酸產物結合后會變為綠色。花青類染料的這種特性可以用來直接判斷核酸擴增反應的結果。但是，花青類染料在液態、常溫下是不穩定的，通常需要溶解在有機溶劑中低溫儲存，不僅耗費電力能源，運輸、使用過程也很不方便。尤其在野外核酸擴增反應試驗中，由于難以實現低溫環境，通常無法應用花青類染料。

而且，花青類染料，例如，SYBR Green I會抑制DNA聚合酶的反應活性，如果在核酸擴增反應前即將花青類染料直接加入PCR管中，則會影響擴增反應進行，且擴增反應中的高溫程序使該類花青類染料很容易失去顯色穩定性。如果在擴增反應完成后，再開蓋加入該類花青類染料，極易造成DNA污染。因此，實現不開蓋直接判讀核酸擴增反應產物的結果，避免產生DNA氣溶膠污染是本領域技術人員需要解決的難題。

發明內容

本發明的目的在于解決現有的花青類染料難以常溫保存的問題，以及解決不開蓋直接判讀核酸擴增反應產物的結果的問題。

因此，本發明提供了一種核酸顯色劑，其特征在于：至少含有花青類染料、花青類染料穩定劑和固定化劑；其中，所述花青類染料穩定劑包括四戊基銨類化合物，所述固定化劑包括高分子聚合物、糖類或兩者的混合物；所述花青類染料的含量為被預定量的所述核酸顯色劑稀釋為100～250X時的量，所述花青類染料穩定劑在所述核酸顯色劑中的濃度為10～100mM，所述糖類的濃度16％～55％(w/v)，所述聚合物的濃度為0.05％～3％(w/v)。

在上述技術方案中，花青類染料穩定劑四戊基銨類化合物混合能夠增加花青類染料在高溫下的耐受性，使得所述核酸顯色劑在室溫下能夠長期保存。以SYBR Green I為例，在沒有添加四戊基銨類化合物的情況下，在常溫狀態下，最多可保存1～2個星期，就會出現檢測靈敏度下降。在添加了四戊基銨類化合物的狀態下，SYBR Green I能夠在常溫甚至高于常溫的條件下長期儲存，其穩定儲存期達到6個月以上。

在上述技術方案中，固定化劑，例如，糖類和高分子聚合物能夠增加核酸顯色劑的粘度。當將該核酸顯色劑進行真空干燥處理，蒸發掉多余的水分后，可將該核酸顯色劑由液態變為粘稠的半固態，使得該核酸顯色劑能夠粘附在PCR反應管蓋中央，因此，在進行核酸擴增反應過程中，該核酸顯色劑不會因受熱融化而滴落到正在進行擴增反應的PCR管中，從而抑制DNA聚合酶的活性，影響擴增反應進行。在空間上，PCR反應管上方為核酸顯色劑，下方為反應體系，反應結束后，只需要上下顛倒，使反應產物與核酸顯色劑混合就可肉眼直接判讀反應結果。無需開蓋操作，因此避免了DNA氣溶膠污染，使反應結果更準確可靠。由于具有固定化劑，一般運輸、儲存、操作過程中的碰撞、震動均不會導致該核酸顯色劑從PCR管蓋中濺出、滴落等。而且，在花青類染料穩定劑和固定化劑存在的條件下，真空干燥處理后的核酸顯色劑具有更加穩定的顯色特征，在反應過程中不會因為經受高溫而丟失顯色特征。