[發(fā)明專利]一種光學(xué)純R-乙偶姻的生產(chǎn)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410341765.1
• 申請日: 2014-07-17
• 公開（公告）號: CN104087602B
• 公開（公告）日: 2017-01-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝能中;黃日波;李檢秀;郭鈴;黃艷燕;杜奇石;王青艷;李億
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西科學(xué)院
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12P7/26;C12R1/19
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務(wù)所有限責(zé)任公司45104
• 代理人: 黃永校

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種光學(xué)純R-乙偶姻的生產(chǎn)方法，具體是將(R,R)-2,3-丁二醇脫氫酶基因(bdh)和葡萄糖脫氫酶基因(gdh)在大腸桿菌中表達(dá)，并以此重組大腸桿菌休止細(xì)胞為生物催化劑，以丁二酮和葡萄糖為底物高效生產(chǎn)光學(xué)純R-乙偶姻的方法。

背景技術(shù)

乙偶姻(acetoin)，即3-羥基-2-丁酮(3-hydroxy-2-butanone)，有兩種旋光異構(gòu)體(R-乙偶姻和S-乙偶姻)，天然地存在于乳品、黃油、干酪、酒類、玉米、葡萄、蘋果、草莓、可可等各類食品中，國家標(biāo)準(zhǔn)GB2760-86規(guī)定其為允許添加食用的食品香料。乙偶姻應(yīng)用廣泛，其具有明顯的奶酪香、脂香特征，主要用于奶油、乳品、咖啡、酸奶等香料的生產(chǎn)。此外，乙偶姻是一種重要的化學(xué)合成中間體和多功能材料，2004年美國能源部將乙偶姻列為30種優(yōu)先開發(fā)利用的平臺化合物之一，可廣泛應(yīng)用于食品、制藥、化工等領(lǐng)域。例如，80％含量的乙偶姻俗稱“醋嗡”，是酒類調(diào)香中一個(gè)極其重要的品種。含有乙偶姻和丁二酮的混合物還可以用來治療乳腺炎。在制藥工業(yè)中，光學(xué)純乙偶姻作為具有立體結(jié)構(gòu)專一的化合物可以用來合成合成具有光學(xué)活性的手性藥物，從而較大程度地提高藥效，減輕藥物的副作用。此外，光學(xué)純乙偶姻還可用于合成手性液晶復(fù)合材料。

光學(xué)純乙偶姻的生產(chǎn)方法主要分為兩類：化學(xué)合成法與生物合成法。化學(xué)合成的原料來源于不可再生的化石資源——石油，原料來源受到限制，且合成過程繁瑣，最后還需要通過化學(xué)法進(jìn)行復(fù)雜的手性拆分，存在成本高、收率低、光學(xué)純度低、高能耗、高污染的問題，因此難以實(shí)現(xiàn)低成本大規(guī)模生產(chǎn)。生物合成方法生產(chǎn)乙偶姻具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如產(chǎn)品綠色天然、反應(yīng)條件溫和、污染少、能耗低，是一種十分具有發(fā)展前景的環(huán)境友好合成方法，近年來受到了越來越多的關(guān)注。然而，天然微生物發(fā)酵產(chǎn)生的一般都是R-乙偶姻和S-乙偶姻的旋光異構(gòu)體混合物，發(fā)酵產(chǎn)物手性拆分工藝繁瑣，成本高昂。1984年，Ui等報(bào)道了利用Pseudomonas?sp.S-4發(fā)酵法合成單一構(gòu)型R-乙偶姻【J.Ferment.Technol.,1984,62:151-156】。該法存在產(chǎn)物濃度低(1.72g/L)和發(fā)酵周期長(48h)的問題。中國專利申請?zhí)朇N201310346916.8于2013年公開了郝健等利用一株克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella?pneumoniae)突變菌株發(fā)酵生產(chǎn)R-乙偶姻，最高產(chǎn)量為35.7g/L。然而，K.pneumoniae被世界衛(wèi)生組織列為致病菌株(Risk?group2，pathogenic?microorganisms)，大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的安全性原則在很大程度上限制了其應(yīng)用【Biotechnol.Adv.,2009,27:715-725；Appl.Environ.Microbiol.,2011,77:5467-5475；Bioresour.Technol.,2012,124:237-244】。

鑒于此，人們嘗試構(gòu)建大腸桿菌基因工程菌株來合成R-乙偶姻。1998年，Ui等將K.pneumoniae編碼α-乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脫羧酶和meso-2,3-丁二醇脫氫酶的基因簇整合到大腸桿菌中，然后將meso-2,3-丁二醇脫氫酶的編碼基因敲除，獲得的重組大腸桿菌可以發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生17.5g/L光學(xué)純R-乙偶姻【Lett.Appl.Microbiol.,1998,26:275-278】，但發(fā)酵法由于發(fā)酵液成分復(fù)雜，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物分離提取困難。此外，該法還存在發(fā)酵周期長和底物轉(zhuǎn)化率低的問題，限制了其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。